Zuverlässig und High Efficiency Extraktion von Nieren-Immunzellen
Summary
Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.
Abstract
Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.
Introduction
Aktivierung des Immunsystems kommt in mehrere Nierenerkrankungen und pathophysiologischen Prozessen 6,10,11,13. Mögliche Bereiche der aktiven Forschung umfassen die verschiedenen Auslöser für die Aktivierung des Immunsystems, verschiedene Zelltypen beteiligt sind, das Cytokin / Chemokin-Muster in einer bestimmten Krankheit Einstellung, Modulation aller der zuvor genannten Verfahren durch ein bestimmtes Medikament usw. Zur Veranschaulichung, in der Ischämie-Reperfusion Schädigung (ein Modell für akutes Nierenversagen), eine Zunahme der Immunzellen oder Knochenmark hämatopoetische Zellen oder CD45 + Zellen innerhalb weniger Stunden abgeleitet ist, die durch die Zeit der Reparatur oder Fibrose (6 Wochen später) 5 aufrechterhalten wird, 12. Diese Immunzellen sekretieren sowohl pro-inflammatorische und anti-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen , den Prozess der Reparatur 5,12 zu dirigieren. Derzeit ist die Fähigkeit, gleichzeitig mehrere Fluorophore zu verwenden Zellpopulationen in einer Einzelzellsuspension zu etikettieren ist mit der Anzeige erhöhtEntlüftung der modernen Durchflusszytometrie Maschinen mit vier vor fünf Lasern. Dies hat zu der Fähigkeit , im wesentlichen zugegeben , um die Zellpopulationen auf ihren funktionellen Status 3,7 basierend zu unterscheiden. Zum Beispiel, beschriften , um genau die Makrophagen als F4 / 80 niedrig CD11b hoch Ly6b hohe CD206 niedrig, mindestens 3 weitere Fluorophore würde in der gleichen Probenvolumen Tor für lebende Zellen, CD45 + (Leukozyten) und Ly6G- (Neutrophile) benötigt werden und dies ist sehr viel möglich mit der neueren Durchflusszytometer 3. Jedoch sind die stromabwärts Assays für Zytokinsekretion, Zellproliferation, Zytotoxizität, Makrophagen-Aktivierung und die Quantifizierung der Anzahl von verschiedenen Untergruppen von Lymphozyten und Monozyten braucht nicht nur gute Qualität (lebenden Zellen, Singuletts), aber eine ausreichende Anzahl von Zellen.
Das Immunsystem in der Niere wird sowohl nach oben als adaptiver und angeborene Komponenten und mehrere Zelltypen 1,7,13. Zum Beispiel bei Mäusen die zwei Kinderneys zusammen berichtet 2-17% (28,000-266,000) CD45 + Zellen der Niere Gesamtimmunzellen zu enthalten , isoliert (1,4 x 10 6 Zellen) und etwa 5-15% (1,400-4,200) von diesen sind CD4 + Zellen 1 , 5,12. Ein kleiner Prozentsatz (5-15%, 70-630) dieser CD4 + FoxP3 + Zellen sind Zellen (Abbildung 1) 1. Aufgrund dieser schrittweise Verringerungen der Prozentsätze der Zellen, die manchmal der Zellpopulation von Interesse (in diesem Fall CD45 + CD4 + FoxP3 + -Zellen) durch eine bloße ~ 100 Zellen dargestellt. Die geringe Zahl der CD45 + CD4 + FoxP3 + -Zellen macht es zwingend notwendig, dass eine große Anzahl von Gesamtzellen werden isoliert und die Zellen sind von guter Qualität für nachfolgende Studien wie Zytokinsekretion Assays. Außerdem kann es notwendig sein, den Nieren von 2 bis 3 Mäusen zu kombinieren, da die Subpopulationen sind nicht in ausreichend hohen Zahlen repräsentiert, um quantifizierbare Assays durchzuführen. Daher zuverlässige und effiziente Isolierung von Nieren mononukleären Zellpopulationen ist wünschenswert, um zu verziereny die immunologische Spektrum mit Nierenerkrankungen in Verbindung gebracht.
Traditionell für die Isolierung von Nieren mononukleären Zellen, haben Forscher eine Vielzahl von enzymatischen Verdauungen wie Kollagenase 1A oder II einschließlich DNase 1 1,5,12 verwendet. Es ist bekannt , daß Kollagenasen enzymatische Aktivität haben , die mit Chargennummern und von der Firma Herstellungs variiert, erfordert Titration für die optimale Konzentration und Dauer der Inkubation 4,14,15. Zusätzlich Verdau mit Kollagenase Zeit für Zerhacken der Niere in kleine Stücke fügt erfordert Inkubation der Nierenstücke in einem geheizten (37 ° C) Bad und zusätzliche Zeit für die Inkubation in EDTA für die Reaktion zu stoppen. Zusätzlich können weniger Sterilität für einige nachgeschaltete Verfahren Kultur benötigen Zelle erreicht werden. Noch wichtiger ist, je nach Prüfer und alle beteiligten Variablen, führt es über Laboratorien in den Daten und Interpretation der Variabilität. Vor kurzem mit derEntwicklung der mechanischen Gewebe Disruptoren / Homogenisatoren 16 wird die Kollagenase – Verdauungsschritt vollständig vermieden und durch eine einfache mechanische Aufschluß der Nieren 2 ersetzt. Hier zeigen wir eine einfache, aber effiziente Methode zur Isolierung von Nierenimmunzellen für die tägliche Immunzellextrakte. Wichtig ist , dass diese Technik auf andere weiche und nicht-faserigen Geweben wie der Leber und im Gehirn 16 angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben hier eine Methode vorgestellt, um Immunzellen aus der Niere in einer zuverlässigen und effizienten Weise zu erhalten. Der Haupt Modifikation der weit verbreiteten Kollagenaseverdau Schritt (mechanische Zerstörung von Gewebe) spart ca. 30 min und die Isolierung einer großen Anzahl von lebensfähigen Immunzellen dauert weniger als zwei Stunden für 4 Nierenproben. Darüber hinaus abhängig von unserer Forschungsfrage, wir jetzt nur eine einzige Niere verwenden für unsere Immunzellisolierung und routinemäßi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.
Materials
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1X RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
Referências
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
