Extração Eficiência confiável e alta de rim células imunes
Summary
Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.
Abstract
Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.
Introduction
A activação do sistema imunitário ocorre em várias doenças renais e processos patofisiológicos 6,10,11,13. As áreas potenciais de investigação activa abranger os vários disparadores para a activação do sistema imunológico, vários tipos de células envolvidos, o padrão de citocinas / quimiocina num ambiente doença em particular, a modulação de todos os processos acima mencionados por um determinado medicamento, etc. Para exemplificar, na isquemia-reperfusão lesão (um modelo de lesão renal aguda), há um aumento em células imunitárias ou de medula óssea derivada de células hematopoiéticas ou CD45 + células dentro de algumas horas, que é sustentado ao longo do período de conservação ou fibrose (6 semanas mais tarde) 5, 12. Estas células imunitárias segregam ambas as citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias e quimiocinas para orquestrar o processo de reparação 5,12. Actualmente, a capacidade para utilizar vários fluoróforos simultaneamente para rotular populações de células numa suspensão de células individuais aumentou com o anúncioventilação de fluxo moderno citometria de máquinas com quatro a cinco lasers. Isto tem substancialmente adicionada à capacidade para discriminar as populações de células com base no seu estado funcional 3,7. Por exemplo, ao etiquetar com precisão um macrófago como F4 / 80 Baixo Alto Alto CD206 Ly6b CD11b baixa, pelo menos mais 3 fluoróforos seria necessário no mesmo volume de amostra a porta para as células vivas, CD45 + (leucócitos) e Ly6G- (neutrófilos) e isso é muito possível com o novo fluxo Citómetros 3. No entanto, os ensaios a jusante para a secreção de citoquina, proliferação celular, a citotoxicidade, a activação de macrófagos e a quantificação dos números de vários subconjuntos de linfócitos e monócitos não só precisa de boa qualidade (células vivas, singuletos) mas um número adequado de células.
O sistema imunológico no rim, é constituído por dois componentes de adaptação e inatas e vários tipos de células 1,7,13. Por exemplo, em ratinhos a dois miúdo+ células Neys juntos são relatados para conter 2-17% (28,000-266,000) CD45 das células do sistema imune de rim total isolado (1,4 x 10 6 células) e cerca de 5-15% (1,400-4,200) destes são células CD4 + 1 , 5,12. Uma pequena percentagem (5-15%, 70-630) destas células CD4 + são FoxP3 + células (Figura 1) 1. Devido a estas etapa reduções sábios em percentagens de células, por vezes, a população de células de interesse (neste caso CD45 + CD4 + Foxp3 + células) é representado por um simples ~ 100 células. O pequeno número de CD45 + CD4 + células FoxP3 + torna imperativo que um grande número de células totais são isoladas e as células são de boa qualidade para estudos a jusante, tais como ensaios de secreção de citocinas. Além disso, pode ser necessário combinar rins 2-3 murganhos uma vez que as subpopulações não são representados em número suficiente altos para realizar ensaios quantificáveis. Por isso, o isolamento fiável e eficaz de populações de células mononucleares do rim é desejável, a fim de estuy o espectro imunológicas associadas com doenças renais.
Tradicionalmente, para o isolamento de células mononucleares de rim, os investigadores têm usado uma variedade de digestões enzimáticas, tais como a colagenase 1A ou II, incluindo ADNase 1 1,5,12. É bem sabido que as colagenases têm actividade enzimática que varia de acordo com os números de lote e pela empresa de fabrico, necessitando de titulação para a concentração óptima e a duração da incubação 4,14,15. Além disso, a digestão com colagenase adiciona tempo para picagem do rim em pedaços pequenos, requer a incubação dos pedaços de rim em A (37 ° C), banho de aquecimento e um tempo adicional para a incubação em EDTA para parar a reacção. Além disso, a menos que a esterilidade pode ser conseguido por alguns processos a jusante que necessitam de cultura de células. Mais importante ainda, dependendo do investigador e todas as variáveis envolvidas, que conduz a variabilidade dos dados e interpretação entre laboratórios. Recentemente, com adesenvolvimento de tecido mecânicos / disruptores homogeneizadores 16, a etapa de digestão de colagenase é completamente evitados e substituídos por uma ruptura mecânica simples dos rins 2. Aqui, nós demonstramos um método simples mas eficaz para o isolamento de células do sistema imunológico nos rins para extrações de células imunes diárias. Mais importante, esta técnica pode ser adaptado para outros tecidos moles e não fibrosos, tais como o fígado e o cérebro 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós apresentamos aqui uma metodologia para obter células imunes de rim de forma confiável e eficiente. A modificação principal para a etapa de digestão de colagenase amplamente utilizado (disrupção mecânica do tecido) economiza cerca de 30 min e o isolamento de um grande número de células viáveis imunes demora menos de duas horas para 4 amostras de rim. Além disso, dependendo da nossa questão de pesquisa, que agora só usar um único rim (o outro rim pode ser utilizado para a análise de proteínas p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.
Materials
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1X RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
Referências
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