Affidabile e di alta efficienza di estrazione del rene cellule immunitarie
Summary
Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.
Abstract
Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.
Introduction
Attivazione del sistema immunitario si verifica in molteplici malattie renali e processi fisiopatologici 6,10,11,13. Potenziali aree di ricerca attiva comprendono vari inneschi per l'attivazione del sistema immunitario, vari tipi cellulari coinvolti, il pattern di citochine / chemochine in una particolare impostazione di malattia, la modulazione di tutti i processi sopra menzionati un particolare farmaco ecc Per esemplificare, in ischemia-riperfusione lesioni (un modello di danno renale acuto), vi è un aumento delle cellule immuni o di midollo osseo derivate cellule ematopoietiche o cellule CD45 + in poche ore, che è sostenuto attraverso il periodo di riparazione o fibrosi (6 settimane dopo) 5, 12. Queste cellule immunitarie secernono entrambe le citochine e chemochine pro-infiammatorie e anti-infiammatori per orchestrare il processo di riparazione 5,12. Attualmente, la possibilità di utilizzare più fluorofori contemporaneamente etichettare popolazioni di cellule in una sospensione singola cella è aumentata con l'annunciosfiato di flusso moderna citometria a macchine con quattro o cinque laser. Ciò ha sostanzialmente aggiunto alla capacità di discriminare le popolazioni cellulari in base al loro stato funzionale 3,7. Ad esempio, per etichettare con precisione un macrofago come F4 / 80 basso alto alto CD206 CD11b Ly6b basso, almeno altre 3 fluorofori sarebbe necessaria nello stesso volume del campione alla porta per le cellule vive, CD45 + (leucociti) e Ly6G- (neutrofili) e questo è molto possibile con il più recente flusso Citometri 3. Tuttavia, i saggi a valle per la secrezione di citochine, proliferazione cellulare, citotossicità, attivazione dei macrofagi e la quantificazione del numero di vari sottoinsiemi di linfociti e monociti non ha bisogno solo di buona qualità (cellule vive, canottiere) ma un numero adeguato di cellule.
Il sistema immunitario nel rene è costituito da due componenti adattivi e innate e più tipi di cellule 1,7,13. Ad esempio, nei topi due kidneys insieme sono segnalati per contenere 2-17% (28,000-266,000) CD45 + cellule delle cellule immunitarie renali totale isolate (1,4 x 10 6 cellule) e circa il 5-15% (1,400-4,200) di queste sono cellule CD4 + 1 , 5,12. Una piccola percentuale (5-15%, 70-630) di queste cellule CD4 + sono FOXP3 cellule + (Figura 1) 1. A causa di queste passo saggio riduzioni percentuali di cellule, a volte la popolazione di cellule (in questo caso CD45 + CD4 + FoxP3 + cellule) è rappresentato da una semplice ~ 100 cellule. Il piccolo numero di FOXP3 cellule CD45 + CD4 + + rende imperativo che un gran numero di cellule totali sono isolati e le cellule sono di buona qualità per gli studi a valle, come test di secrezione di citochine. Inoltre, può essere necessario combinare reni da 2-3 topi poiché le sottopopolazioni non sono rappresentati in numero sufficientemente elevate per eseguire saggi quantificabili. Pertanto, l'isolamento affidabile ed efficiente di popolazioni di cellule mononucleate rene è auspicabile per vite prigionieray lo spettro immunologica associata a malattie renali.
Tradizionalmente, per l'isolamento delle cellule mononucleari del rene, i ricercatori hanno utilizzato una varietà di digestioni enzimatiche quali 1A collagenasi o II compreso DNasi 1 1,5,12. È ben noto che collagenasi hanno attività enzimatica che varia con numeri di lotto e per società di produzione, che richiede la titolazione per la concentrazione ottimale e durata dell'incubazione 4,14,15. Inoltre, la digestione con collagenasi aggiunge tempo per tritare il rene in piccoli pezzi, necessita incubazione dei pezzi rene in un bagno riscaldato (37 ° C) ed il tempo supplementare per incubazione in EDTA per fermare la reazione. Inoltre, meno sterilità può essere ottenuto ad alcune procedure valle necessitano coltura cellulare. Ancora più importante, a seconda del ricercatore e tutte le variabili coinvolte, porta alla variabilità dei dati e l'interpretazione di tutti i laboratori. Recentemente, con lasviluppo di meccanici tessuto Disgregatori / omogeneizzatori 16, la fase di collagenasi digestione viene completamente evitato e sostituito da un semplice distruzione meccanica dei reni 2. Qui, dimostriamo un metodo semplice ma efficace per l'isolamento delle cellule immunitarie di rene per tutti i giorni estrazioni cellule immunitarie. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattato ad altri tessuti molli e non fibrose come il fegato e il cervello 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato qui un metodo per ottenere cellule immunitarie dal rene in modo affidabile ed efficiente. La modifica principale al passaggio digestione collagenasi ampiamente utilizzato (rottura meccanica del tessuto) risparmiare circa 30 min e l'isolamento di un gran numero di cellule immunitarie vitali richiede meno di due ore per 4 campioni renali. Inoltre, a seconda della nostra domanda di ricerca, ora usiamo un solo rene (l'altro rene può essere utilizzato per l'analisi delle proteine da West…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.
Materials
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1X RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
Referências
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
