Надежность и высокая эффективность Извлечение почки иммунных клеток
Summary
Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.
Abstract
Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.
Introduction
Иммунной активации системы происходит в нескольких заболеваниях почек и патофизиологических процессов 6,10,11,13. Потенциальные области активного исследования охватывают различные триггеры для активации иммунной системы, различные типы клеток участвуют, шаблон цитокина / хемокина в конкретных условиях заболевания, модуляция всех вышеуказанных процессов, с помощью конкретного препарата и т.д. В качестве примера, в ишемии травмы (модель для острого повреждения почек), происходит увеличение в иммунных клеток или костного мозга происходит кроветворные клетки или CD45 + клетки в течение нескольких часов, которое поддерживается через период ремонта или фиброза (6 недель спустя) 5, 12. Эти иммунные клетки секретируют как провоспалительные и противовоспалительные цитокины и хемокины , чтобы организовать процесс ремонта 5,12. В настоящее время возможность использования нескольких флуорофоров одновременно для обозначения популяции клеток в суспензии отдельных клеток увеличилось с объявлениемотдушина современной проточной цитометрии машин с четырех до пяти лазеров. Это , по существу , добавил к способности различать популяции клеток в зависимости от их функционального состояния 3,7. Например, чтобы точно обозначить макрофаг , как F4 / 80 с низким CD11b высокой Ly6b высокой CD206 низкой, по крайней мере , еще 3 флуорофоры будут необходимы в том же объеме выборки для ворот для живых клеток, CD45 + (лейкоциты) и Ly6G- (нейтрофилы) и это очень возможно с новой Flow цитометры 3. Тем не менее, ниже по течению анализы на секрецию цитокина, пролиферации клеток, цитотоксичность, активацию макрофагов и квантификации числа различных подмножеств лимфоцитов и моноцитов, не только требует хорошего качества (живые клетки, фуфайки), но достаточное количество клеток.
Иммунная система в почках состоит из обоих адаптивных и врожденных компонентов и различные типы клеток 1,7,13. Например, у мышей два ребенокNeys вместе , как сообщается, содержат 2-17% (28,000-266,000) CD45 + клеток иммунной клетки почек общий изолированных (1,4 х 10 6 клеток) и около 5-15% (1,400-4,200) из них являются клетки CD4 + 1 , 5,12. Небольшой процент (5-15%, 70-630) этих клеток CD4 + являются FOXP3 + клеток (рисунок 1) 1. В связи с этим шагом мудрых сокращений в процентах клеток, иногда популяции клеток, представляющих интерес (в данном случае CD45 + CD4 + FoxP3 + клетки) представлена простым ~ 100 клеток. Небольшое количество CD45 + CD4 + FOXP3 + клеток делает необходимым, что большое число полных клеток, выделяют и клетки имеют хорошее качество для последующих исследований, таких как анализы секрецию цитокинов. Кроме того, это может быть необходимо, чтобы объединить почки от 2-3 мышей, так как субпопуляции не представлены в достаточно большом количестве для выполнения количественному анализов. Следовательно, надежной и эффективной изоляции популяций почек мононуклеарных клеток желательно, чтобы шпилькау иммунологический спектр, связанный с заболеваниями почек.
Традиционно для выделения мононуклеарных клеток почек, исследователи использовали различные ферментативные пищеварением , таких как коллагеназы 1A или II , включая ДНКазы 1 1,5,12. Хорошо известно , что коллагеназы имеют ферментативную активность, изменяющуюся с серийными номерами и компанией производства, что делает необходимым титрование для оптимальной концентрации и продолжительности инкубации 4,14,15. Кроме того, вываривание коллагеназы добавляет время для фарша почки на мелкие кусочки, вызывает необходимость инкубации кусочков почек в нагретую (37 ° С) ванны и дополнительное время для инкубации в ЭДТА для остановки реакции. Кроме того, менее стерильность может быть достигнуто в течение нескольких последующих процедур, нуждающихся в клеточной культуре. Что еще более важно, в зависимости от исследователя и всех переменных, участвующих, это приводит к изменчивости в данных и интерпретации между лабораториями. В последнее время, сразвитие механических тканей разрушителями / гомогенизаторов 16, стадия коллагеназы полностью исключается и заменяется простым механическим разрушением почек 2. Здесь мы покажем простой, но эффективный метод выделения почек иммунных клеток для повседневных извлечений иммунных клеток. Важно отметить, что эта методика может быть адаптирована к другим мягкими и не фиброзной ткани , такие как печень и мозг 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представили здесь методику для получения иммунных клеток из почки в надежной и эффективной. Основная модификация к широко используемым шагом коллагеназы (механическое разрушение ткани) экономит около 30 мин и выделение большого количества жизнеспособных клеток иммунной системы за…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.
Materials
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1X RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
Referências
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
