Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten
Summary
The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.
Abstract
This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.
Introduction
Hematopoiese is een complex ontwikkelingsproces waarbij hematopoietische stamcellen (HSCs) knop uit hemogenic endothelium aanwezig in diverse embryonale hematopoietische sites zoals de aorta-Gonade-mesonephros en placenta 1,2. Het onvermogen cultuur HSCs in vitro voorkomt de grondige analyse van dit proces en de klinische toepassing van deze studies. Om deze beperking te omzeilen, hebben eerdere studies geprobeerd om af te leiden HSC de novo hetzij via differentiatie van pluripotente stamcellen (PSC) 3, of geïnduceerde plasticiteit in somatische cellen en geregisseerd differentiatie met behulp van het herprogrammeren van media 4,5. Deze onderzoeken echter genereren geen klinisch veilig engraftable cellen of toestaan studie van ontwikkeling definitieve hematopoiese "in een schotel."
De roman werk die door Yamanaka en collega's voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van somatische fibroblasten provides een kader voor transcriptiefactor (TF) op basis van overexpressie strategieën herprogrammering lot van de cel 6,7. Dit werk is in verschillende gebieden gevraagd onderzoekers om celtypen van keuze te genereren via TF herprogrammering van gemakkelijk verkrijgbaar somatische cellen. Het doel van de herprogrammering strategie hier beschreven een hemogenic werkwijze uit muizen somatische cellen met een TF gebaseerde herprogrammering benadering met als doel deze bevindingen neerkomt op het menselijke systeem patiëntspecifieke fibroblasten herprogrammeren om humane hematopoiese onderzoeken in vitro en induceren genereren patiëntspecifieke bloedproducten ziektemodel, drug testen en stamceltransplantatie.
De eerste stap om juiste herprogrammering in deze muis te verzekeren werd een reporter lijn die diende als een uitlezing voor CD34 expressie, een bekende merker in endotheliale progenitorcellen en HSCs ontwikkelen. Om dit te doen, werden de huCD34-tTA en TetO-H2BGFP transgene muis lijnen gebruikt om generate dubbele transgene muis embryonale fibroblasten (MEF), nu aangeduid 34 / H2BGFP, dat groene bij activering van de CD34 promotor 8 fluoresceren. Dit maakte screening van verschillende TF bekend vereist op verschillende momenten tijdens hematopoietische specificatie en ontwikkeling. Beginnend met 18 TF's in PMX retrovial vectoren (bepaald door middel van literatuur en profilering van GFP label behoud van HSC uit de eerder beschreven 34 / H2BGFP muizen), 34 / H2BGFP MEFs werden getransduceerd met alle factoren en gekweekt op AFT024 HSC-ondersteunende stromale cellen. Na de detectie van 34 / H2BGFP activering, werden TF vervolgens verwijderd uit de herprogrammering cocktail tot de optimale set van TFS reporter activering werd geïdentificeerd. Na deze eerste screen werden de factoren naar een DOX pFUW induceerbaar vectorsysteem voor expressie regelbaar van het TF mogelijk. Aangezien beide DOX controleerbare onverenigbaar (de 34 / H2BGFP cellen en de pFUW induceerbare vectoren), MEF uitwild-type C57BL / 6 muizen werden vereist. Het was ook nodig om een geschikte micro-omgeving te laten hemogenesis om verder te gaan en maak multilineage klonogene voorlopercellen te bieden.
Huidige studies een poging om somatische cellen te herprogrammeren in hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPCs) hebben uiteenlopende niveaus van succes 9-11 voldaan. Tot op heden heeft het opwekken van zowel muis en mens transplantable HSPCs met de lange termijn en zelf-vernieuwing repopulatie vermogen niet is bereikt met behulp van dezelfde set van TF's. In dit protocol bieden wij een gedetailleerde beschrijving van de eerder vastgestelde strategie reproduceerbaar hemogenesis induceren in MEFs. We tonen aan dat de invoering van een minimaal aantal TF's (Gata2, Gfi1b, cFos en ETV6) kan aanzetten tot een complex ontwikkelingsprogramma in vitro dat een platform waarmee ontwikkeling hematopoiese en klinische toepassing van hematopoietische herprogrammering verder kan worden onderzocht 12 verschaft.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genereren HSPCs de novo uit makkelijk bereikbaar somatische cellen een unieke methode om hematopoëse in vitro, en de mogelijkheid te bestuderen om potentieel deze technologie toe te passen op het menselijk lichaam. Deze vertaling zou een nieuw instrument genereren menselijke hematologische ziekte te bestuderen in een schotel, en verstrekt drug testplatformen en gene targeting mogelijkheden talrijke aandoeningen met nieuwe therapieën of HSC transplantaties behandelen. Ter plaatse recente studies uitge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45uM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18G needles | BD | 305195 | |
| 20G needles | BD | 305175 | |
| 25G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65uM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
Referências
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
- Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
- Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
- Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
- Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
- Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
- Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
- Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
- Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
- Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. “Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).
