転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために
Summary
The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.
Abstract
This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.
Introduction
造血は、造血幹細胞（HSC）の複雑な発達過程は、大動脈-生殖腺-中腎および胎盤1,2-として胚造血の様々な部位に存在する造血内皮を出芽されています。 体外培養のHSCにできないことは、このプロセスの深さの分析だけでなく、これらの研究の臨床応用を防ぐことができます。この制限を回避するには、以前の研究を導出することを試みてきたのHSC デノボ再プログラミングメディア4,5を使用して、多能性幹細胞（PSCに）3、または体細胞における誘起塑性と向かう分化の分化を介しました。これらの研究は、しかし、臨床的に安全なengraftable細胞を生成したり、決定的な発達造血の研究ができない」皿の中を。」
体細胞、線維芽細胞のpから人工多能性幹細胞（性IPSC）を生成するために、山中らによって確立された新規の仕事転写因子（TF）の再プログラミング細胞の運命6,7におけるベースの過剰発現戦略の枠組みをrovides。この作品は、容易に得られる体細胞のTFの再プログラミングを経由して、選択した細胞型を生成するために、いくつかの分野での研究者を求めています。ここで説明する再プログラミング戦略の目的は、 インビトロでヒト造血を研究するために、患者特有の線維芽細胞を再プログラムするために人間のシステムにこれらの結果を変換する目的でTF基づく再プログラミングアプローチを用いて、マウスの体細胞から造血プロセスを誘導することであると疾患モデル、薬物試験のための患者特有の血液製剤を生成し、幹細胞移植。
このマウス系で適切な再プログラミングを確保するための最初のステップは、CD34発現、内皮前駆細胞と造血幹細胞の既知のマーカーの読み出しを務めレポーターラインを開発することでした。これを行うには、huCD34-のtTAとのtetO-H2BGFPトランスジェニックマウス系統は、グラムに使用されましたenerateダブルトランスジェニックマウス胚線維芽細胞（MEFが）、今CD34プロモーター8の起動時に緑色の蛍光を発する34 / H2BGFPを表します。これは、造血仕様と開発中の異なるポイントで必要とされることが知られているTFの様々なスクリーニングを可能にしました。 pMX retrovialベクターにおける18のTFを皮切り34 / H2BGFP MEFがAFT024間質細胞をHSCが支持上のすべての要因と培養で形質導入した、（34 / H2BGFPマウスを記載した文献マイニングと以前からHSCを保持GFPラベルのプロファイリングにより決定）。レポーター活性化TFの最適なセットが同定されるまで34 / H2BGFP活性化を検出した後、のTFは、その後、再プログラミングカクテルから除去しました。この初期画面の後、要因はTFの制御可能な発現を可能にするDOX誘導性pFUWベクター系に移しました。これら2 DOXの制御システムは、からのMEF（34 / H2BGFP細胞とpFUW誘導性ベクター）は互換性がありませんので、野生型C57BL / 6マウスを必要としました。 hemogenesisが進行し、多クローン原性前駆細胞を作成することを可能にするための適切な微小環境を提供するためにも必要でした。
造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）に体細胞を再プログラムしようとする現在の研究は、成功9-11の様々なレベルを満たしています。現在までに、マウスおよび長期自己更新再増殖能力を有するヒト移植HSPCs両方の生成がTFの同じセットを使用して達成されていません。このプロトコルでは、再現性MEFにおけるhemogenesisを誘導する以前に確立された戦略の詳細な説明を提供します。私たちは、最小限のTFのセット（GATA2、Gfi1b、のCFO、およびETV6）の導入は、造血再プログラミングの発達造血及び臨床応用は、さらに12を研究することが可能なプラットフォームを提供し、in vitroでの複雑な発生プログラムを扇動することが可能であることを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
容易に達成体細胞から生成HSPCs デノボは、in vitroで造血を研究するためのユニークな方法、および潜在的に人間のシステムにこの技術を適用する機会を提供しています。この変換は、皿の中で、人間の血液学的疾患を研究するだけでなく、新規治療薬またはHSC移植で多数の障害を治療するための機会をターゲットに薬物検査プラットフォームと遺伝子を提供するための新?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45uM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18G needles | BD | 305195 | |
| 20G needles | BD | 305175 | |
| 25G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65uM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
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