Reprogrammation fibroblastes embryonnaires de souris avec les facteurs de transcription pour induire un programme Hemogenic
Summary
The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.
Abstract
This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.
Introduction
Hématopoïèse est un processus de développement complexe où les cellules souches hématopoïétiques (CSH) bourgeonnent off endothélium hemogenic présents dans une variété de sites hématopoïétiques embryonnaires tels que l'Aorte-gonades-Mésonéphros et le placenta 1,2. L'incapacité de la culture CSH in vitro empêche l'analyse en profondeur de ce processus ainsi que l'application clinique de ces études. Pour contourner cette limitation, des études antérieures ont tenté de tirer CSH de novo soit par la différenciation des cellules souches pluripotentes (PSC) 3, ou la plasticité induite dans les cellules somatiques et la différenciation dirigée en utilisant les médias de reprogrammation 4,5. Ces études, cependant, ne génèrent pas de cellules engraftable cliniquement sûres ou permettent l'étude de l'hématopoïèse de développement définitif "dans un plat."
Le travail de roman créé par Yamanaka et ses collègues pour générer induit des cellules souches pluripotentes (CISP) de fibroblastes somatique provides un cadre pour le facteur de transcription (TF) des stratégies de surexpression sur la base de reprogrammation cellulaire destin 6,7. Ce travail a incité les enquêteurs dans plusieurs domaines pour générer les types de choix de cellules via TF reprogrammation de cellules somatiques faciles à obtenir. L'objectif de la stratégie de reprogrammation décrite ici est d'induire un processus hemogenic à partir de cellules somatiques de souris en utilisant une approche de reprogrammation de TF basée dans le but de traduire ces résultats pour le système humain de reprogrammer des fibroblastes spécifiques au patient afin d'étudier l' hématopoïèse humaine in vitro et générer spécifiques aux patients des produits sanguins pour la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues, et greffe de cellules souches.
La première étape pour assurer la reprogrammation appropriée dans ce système de la souris était de développer une ligne de journaliste qui a servi une lecture pour l'expression de CD34, un marqueur connu dans les cellules progénitrices endothéliales et CSH. Pour ce faire, les lignées de souris transgéniques huCD34-tTA et TetO-H2BGFP ont été utilisés pour generate des fibroblastes de souris transgéniques doubles embryonnaires (MEF), maintenant notée 34 / H2BGFP, qui fluoresce vert lors de l' activation du promoteur de CD34 8. Cela a permis le dépistage d'une variété de TFs connus pour être nécessaires à différents moments de la spécification et le développement hématopoïétique. A partir de 18 TFs dans PMX vecteurs rétroviraux (déterminés par l'exploitation de la littérature et le profilage de l'étiquette de la GFP conservant CSH de la décrit précédemment 34 souris / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs ont été transduites avec tous les facteurs et de culture sur AFT024 HSC-cellules de soutien stromales. Après la détection de 34 activation / H2BGFP, TFs ont ensuite été retirés du cocktail de reprogrammation jusqu'à ce que l'ensemble optimal de TFS pour l'activation du journaliste a été identifié. Après cet écran initial, les facteurs ont été transférés à un système de vecteur PFUW inductible DOX pour permettre l'expression contrôlable des TFs. Étant donné que ces deux systèmes contrôlables DOX sont incompatibles (les 34 cellules / H2BGFP et les vecteurs inductibles PFUW), MEFs deC57BL / 6 souris de type sauvage ont été nécessaires. Il était également nécessaire de prévoir un microenvironnement approprié pour permettre hemogenesis de procéder et de créer progéniteurs clonogéniques multilignée.
Les études actuelles qui tentent de reprogrammer des cellules somatiques en cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) ont rencontré des niveaux variés de succès 9-11. À ce jour, la génération de la souris et HSPCs transplantables humains avec long terme et la capacité de repopulation auto-renouvellement n'a pas été réalisé en utilisant le même ensemble de TFs. Dans ce protocole, nous fournissons une description détaillée de la stratégie précédemment établie pour induire reproductible hemogenesis en MEF. Nous démontrons que l' introduction d'un ensemble minimal de TFS (Gata2, Gfi1b, cFos et ETV6) est capable d' être l' instigateur d' un programme de développement complexe in vitro qui fournit une plate – forme par laquelle l' hématopoïèse développement et l' application clinique de la reprogrammation hématopoïétiques peuvent encore être étudiés 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Génération HSPCs de novo à partir de cellules somatiques facilement réalisables offre une méthode unique pour étudier l' hématopoïèse in vitro, et la possibilité de potentiellement appliquer cette technologie au système humain. Cette traduction générerait un nouvel outil pour étudier la maladie hématologique humaine dans un plat, ainsi que de fournir des plates-formes de dépistage des drogues et ciblage génétique des possibilités de traiter de nombreux troubles avec de nouveaux p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45uM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18G needles | BD | 305195 | |
| 20G needles | BD | 305175 | |
| 25G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65uM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
Referências
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