Перепрограммирование эмбриональных фибробластов мыши с транскрипционных факторов для индуцирования кроветворения программы
Summary
The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.
Abstract
This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.
Introduction
Гемопоэз представляет собой сложный процесс развития , при котором гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) бутона от гемогенного эндотелий присутствовать в различных эмбриональных сайтах гемопоэтических такие как аорта-гонад-мезонефрос и плацента 1,2. Неспособность культуры ГСК в пробирке предотвращает глубокий анализ этого процесса, а также клиническое применение этих исследований. Чтобы обойти это ограничение, предыдущие исследования попытались вывести ГСК заново либо с помощью дифференциации плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК) 3, или индуцированной пластичности в соматических клетках и направленной дифференцировки с помощью перепрограммирования СМИ 4,5. Эти исследования, однако, не приводят к клинически безопасных engraftable клеток или позволяют изучение окончательного кроветворения развития "в чашке".
Роман работа устанавливается Яманака и его коллеги, чтобы генерировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из соматической фибробласты рrovides рамки для фактора транскрипции (TF) стратегий избыточной экспрессии на основе клеток в судьбе перепрограммирования 6,7. Эта работа побудила исследователей в различных областях, чтобы генерировать типы клеток выбора через TF перепрограммирования легкодоступных соматических клеток. Цель стратегии перепрограммирования , описанного здесь , чтобы вызвать гемогенного процесс от мыши соматических клеток с использованием TF на основе перепрограммирования подхода с целью воплощения этих результатов в человеческой системе перепрограммировать фибробласты конкретного пациента для того , чтобы изучить человека кроветворение в пробирке и генерировать пациента конкретных продуктов крови для моделирования заболевания, тестирования на наркотики и трансплантации стволовых клеток.
Первым шагом для обеспечения надлежащего перепрограммирование в этой системе мыши было разработать линию репортер, который служил в качестве чтения-аута для экспрессии CD34, известным маркером в эндотелиальных клетках-предшественниках и ГСК. Для этого, трансгенные линии мыши huCD34-TTA и Teto-H2BGFP были использованы для гenerate двойной трансгенной мыши эмбриональные фибробласты (МЭФ), теперь обозначается 34 / H2BGFP, что флуоресцировать зеленым при активации промотора CD34 8. Это позволило скрининг различных ТФ, как известно, требуется в различных точках во время кроветворной спецификации и развития. Начиная с 18-ТФ в PMX retrovial векторов (определяется путем добычи и профилирования GFP этикетки удерживающих ГСК из ранее литературы описаны 34 мышей / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs были трансдуцированных со всеми факторами и культивируют на AFT024 HSC поддерживающих стромальных клеток. После обнаружения 34 активации / H2BGFP, ТФ были впоследствии удалены из перепрограммирования коктейля, пока не был идентифицирован оптимальный набор ТФ для активации репортера. После этого начального экрана, факторы, были переведены в DOX индуцибельной векторной системы pFUW, чтобы позволить управляемое экспрессию ТФ. Так как эти две управляемые системы DOX несовместимы (34 / H2BGFP клетки и индуцируемые векторы pFUW), MEFs изтребовалось 6 мышей дикого типа C57BL /. Кроме того, необходимо обеспечить соответствующую микросреду, чтобы позволить гемопоэз, чтобы продолжить и создать мультилинейной клоногенные клетки-предшественники.
Современные исследования пытаются перепрограммировать соматические клетки в гемопоэтических стволовых клеток и клеток – предшественников (HSPCs) встречались различные уровни успеха 9-11. На сегодняшний день, поколение как мыши и перевиваемых HSPCs человека с длительным сроком и самообновлению заселив способность не была достигнута с использованием того же набора ТФ. В этом протоколе, мы приводим подробное описание ранее установленной стратегии воспроизводимо индуцируют гемопоэз в MEFs. Показано , что введение минимального набора ТФ (Gata2, Gfi1b, CFO , и Etv6) способен подстрекательстве комплексную программу развития в пробирке , которая обеспечивает платформу , с помощью которого кроветворения развития и клиническое применение гемопоэтических перепрограммирования может быть дополнительно изучена 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Создание HSPCs De Novo из легко достижимых соматических клеток предлагает уникальный метод для изучения кроветворения в пробирке, и возможность потенциально применять эту технологию для человеческой системы. Этот перевод будет генерировать новый инструмент для изучения болезни…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45uM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18G needles | BD | 305195 | |
| 20G needles | BD | 305175 | |
| 25G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65uM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
Referências
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
- Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
- Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
- Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
- Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
- Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
- Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
- Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
- Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
- Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. “Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).
