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好気性グラニュール汚泥からの構造細胞外高分子物質の抽出

Published: September 26, 2016 doi: 10.3791/54534

Simon Felz¹, Salah Al-Zuhairy¹, Olav Andreas Aarstad², Mark C.M. van Loosdrecht¹, Yue Mei Lin¹

¹Department of Biotechnology, Delft University of Technology, ²Department of Biotechnology, Norwegian Biopolymer Laboratory (NOBIPOL), Norwegian University of Science and Technology

Summary

プロトコルは、アルギン酸塩のような細胞外ポリマー（ALE）を抽出するために、好気性粒状汚泥を可溶化するための方法論を提供します。

Introduction

近年では、好気性グラニュール汚泥（AGS）プロセスが正常にいくつかの本格的な下水処理場¹で適用された人気の生物学的廃水処理プロセス、となっています。従来の活性汚泥法とは対照的に、AGSが処理中の微生物ではなく、フロック²の顆粒を形成します。これらの顆粒は、より良いsettleabilityを持っている高い有機物負荷率に耐えることができる、と活性汚泥フロック³よりも毒性の高い耐性を有します。

バイオフィルムとは異なり、AGSは、任意の担体材料⁴の関与なしに自然に形成されています。 ⁶ ^- AGSでは、バイオフィルムのように、微生物は、それらが自己固定化⁴である、ヒドロゲルマトリックスを形成するために、高度に水和した細胞外ポリマー物質^（EPS）5を大量に生成します。 EPSはphosp（多糖類、タンパク質、核酸からなる、複雑な混合物でありますホ）脂質、腐植物質および一部の間ポリマー^5,7,8。これらの高分子物質は、緻密かつコンパクトな三次ネットワーク構造を形成し、静電気力、水素結合、魅力的なイオン力及び/又は生化学的反応、等 ^5を介して相互作用します。ヒドロゲル^4,9を形成し、第三のネットワーク構造の形成に寄与することが可能であるEPSにおけるポリマーは、構造EPS、合計EPSのサブセットとして考え、この点にあります。

EPSは、化学構造および顆粒⁵の物理的性質の原因です。各EPS化合物の機能を理解することが重要です。 ¹⁵ ^-様々なアプローチがEPS ^10を抽出するために適用されます。しかしながら、それらの極端な複雑さのために、単一の方法で、すべてのEPSの成分を抽出することはほとんど不可能です。現在まで、EPS抽出のための方法 "ワンサイズはすべてに適合していない」があります。 ²⁰ ^-抽出方法の選択は、合計金額が、また、回収されたポリマー^13,16の組成だけでなく、影響を与えます。汚泥の種類に応じて、関心の異なる方法のEPSが必要とされています。

、ゲル形成ポリマーを抽出し、それらの特性を特徴付けるし、お互いにそれらの相互作用を調査し、非ゲル形成とEPSは好気性グラニュール汚泥形成におけるEPSの役割を明らかにするのに役立ちます。また、ゲル形成ポリマーはまた、工業用途において有用生体高分子です。一つの可能なアプリケーションは、既に紙²¹の耐水性を高めるためにコーティング材料としてAGSからのゲル形成ポリマーを使用することによって示されました。

したがって、ゲル形成EPSに特異的な抽出方法は、必要とされています。本研究の目的は、AGSからゲル形成EPSを抽出する方法を開発することです。シックス抽出方法^{^¹⁰から1}頻繁に文献で使用されている5,22は、AGSからEPSを抽出するために選択しました。総量抽出EPSのゲル形成特性は、各方法について比較しました。

Protocol

注：AGSは、廃水処理プラントユトレヒト、オランダでNeredaパイロット反応器から回収しました。反応器は、都市下水を供給しました。グラニュール汚泥は59.5ミリリットル/ gでの_VSSの汚泥容量指標（SVIの_5分）を有し_ていました。汚泥は好気性サイクルの終わりに4月に採取しました。サンプリング後、スラッジを直ちに研究室に輸送篩い分け、使用するまで-20℃で保存しました。

1. EPSの抽出

注：4000×gで、20分間4℃で遠心分離粒状汚泥、上清をデカント。抽出のためのペレット中の顆粒を収集します。顆粒の全固形分（TS）及び揮発性固体（VS）は、標準的な方法²³によって決定されました。ペレットから直接採取した顆粒の重量 - - 顆粒湿重量との間の変換係数とTSを抽出前に測定しました。すべての抽出は三連で行われました。

注：3グラムのウェットグラムranules各抽出方法のために使用しました。三連で測定され、それらのTSとVSの値（0.39グラムTS 0.34 gでVS）は、抽出収率を計算しました。

遠心分離抽出¹¹
1. 遠心分離管に顆粒の3グラム（湿重量）を転送し、脱イオン水で50mlに遠心チューブを埋めます。
2. 少し手で遠心チューブを振ります。
3. 遠心分離機20分間4,000×gで、4℃で混合物を含有する遠心管。
4. 、ガラスビーカーに上清を収集し、ペレットを廃棄して、セクション1.7で説明したように、上清を続行します。
超音波処理抽出¹⁰
1. 遠心分離管に顆粒の3グラム（湿重量）を転送し、脱イオン水で50mlに遠心チューブを埋めます。
2. 混合物に40 Wで2.5分間氷上にパルス状の超音波処理を適用します。
3. 遠心分離を遠心20分間の4000×gおよび4℃で混合物を含有するチューブ。
4. 、ガラスビーカーに上清を収集し、ペレットを廃棄して、セクション1.7で説明したように、上清を続行します。
エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の抽出¹¹
1. 100mlのガラスボトルに顆粒の移送3グラム（湿重量）および2％（w / v）のEDTA溶液で50mlにボトルを埋めます。
2. 少し手でボトルを振るし、3時間、4℃の冷蔵庫に保管してください。
3. 50ミリリットルの遠心分離管に混合物を転送します。
4. 遠心分離機20分間4,000×gで、4℃で混合物を含有する遠心管。
5. 、ガラスビーカーに上清を収集し、ペレットを廃棄して、セクション1.7で説明したように、上清を続行します。
ホルムアミド-水酸化ナトリウム抽出（NaOHで^）13
1. 100への顆粒の転送3グラム（湿重量）mlのガラス瓶や脱イオン水で50mlにボトルを埋めます。
2. 0.3ミリリットル99％ホルムアミドを追加します。
3. 少し手でボトルを振る、1時間、4℃の冷蔵庫に保管してください。
4. 顆粒懸濁液に20ミリリットル1MのNaOHを追加します。
5. 少し手でボトルを振るし、3時間、4℃の冷蔵庫に保管してください。
6. 2 50ミリリットルの遠心分離管に均等に混合物を転送します。
7. 遠心分離機20分間4,000×gで、4℃で混合物を含む遠心分離チューブは
8. 、ガラスビーカーに上清を収集し、ペレットを廃棄して、セクション1.7で説明したように、上清を続行します。
ホルムアルデヒド- NaOHを抽出¹¹
1. 100ミリリットルのガラスボトルに顆粒の転送3グラム（湿重量）と脱イオン水で50mlにボトルを埋めます。
2. 0.3ミリリットル37％ホルムアルデヒドを追加します。
3. 少し手とストアによってボトルを振ります1時間4℃で冷蔵庫でそれ。
4. 顆粒懸濁液に20ミリリットル1MのNaOHを追加します。
5. 少し手でボトルを振るし、3時間、4℃の冷蔵庫に保管してください。
6. 2 50ミリリットルの遠心分離管に均等に混合物を転送します。
7. 遠心分離機20分間4,000×gで、4℃で混合物を含む遠心分離チューブは
8. 、ガラスビーカーに上清を収集し、ペレットを廃棄して、セクション1.7で説明したように、上清を続行します。
高温-炭酸ナトリウム抽出し（Na ₂ CO _{^{3）、9,22,24}}
1. 予熱150は80°Cまでマグネチックスターラーで1,000ミリリットルのガラス製ビーカーに水道水mLです。
2. フラスコを250mlバッフル内顆粒の転送3グラム（湿重量）と脱イオン水で50mlにフラスコを埋めます。
3. 0.25グラムのNa ₂ CO _3、無水または0.67グラムのNa ₂ CO _3•10Hを追加2 CO ₃濃度（w / v）の0.5％を得るために、フラスコにUB> 2 O。
4. 水浴に混合物を含むフラスコを置きます。蒸発を防ぐためにアルミホイルで別々にフラスコ、ビーカーガラスを覆います。
5. 400回転および80℃で35分間、混合物を撹拌しました。
6. 50ミリリットルの遠心分離管に混合物を転送します。
7. 遠心分離機20分間4,000×gで、4℃で混合物を含有する遠心管。
8. 上清を収集し、ペレットを捨てます。
TSと標準的な方法²³に従って、すべての抽出物のVS測定。
1. 上清を取り、千ミリリットル超純水（カットオフ3500ダ分子量（MWCO）で透析バッグ^）11,12に対する24時間のためにそれを透析。透析の効果を高めるために、12時間後に透析水を変更します。
2. 透析上清（1/3程度）に合理的な割合を転送TSとVS測定²³用のアルミ皿。
  注：一晩105℃でサンプルを乾燥させます。空のアルミニウム皿および乾燥した試料を含むアルミニウム皿の重量差は、TSコンテンツです。その後、2時間550℃でサンプルを含む同じアルミニウム皿を焼きます。空のアルミニウム皿て燃焼サンプルを含むアルミニウム皿の重量差は灰分です。 TSと灰分との差がVSコンテンツです。
3. 各抽出物について、10ミリリットルのガラスビーカーに透析した上清の残留割合を移します。上清中のポリマー濃度を増加させる1〜2 mlの最終容積に60℃で2日間、上清を厚く。

2.アルギン酸のような細胞外ポリマー（ALE）の抽出

ステップ1.7.1に従ってステップ1.6.8で得られた抽出液を透析。
250mlのガラスビーカーに透析した抽出物を転送します。スローlyが100rpmで、室温で抽出をかき混ぜます。酸性形態でALEを得るために、2.2±0.05の最終pHに1 M塩酸（HCl）を添加しながら絶えず、pH電極でpHの変化を監視します。
2.2にpHを調整した後、4,000×gで50mlの遠心管遠心に抽出物を転送し、20分間、4°C。
上清を捨て、ゲル状のペレットを収集します。ゲル状のペレットは、酸性形態でALEです。
pHが8.5になるまで手でガラス棒でゆっくりとゲルを混合しながら、ゆっくりと、ステップ2.4で得られたゲルを、0.5MのNaOH（または0.5 M水酸化カリウム）を追加し、ナトリウム（またはカリウム）ALEの形を得るために。

3.イオン性ハイドロゲル形成試験

注：抽出されたEPSは、イオン性ヒドロゲル形成特性を有していたかどうかを確認するために、 ^の Ca ²⁺イオンとビード形成試験は^、25を使用しました。

ステップ1.7.3での抽出物の増粘にした後、1〜2ミリリットルの容量は、ゆっくりとガラス棒で混合物を攪拌し、0.5M NaOHで8.5に、そのpHを調整します。
ステップ3.1の抽出物またはステップ2.5のナトリウムALEを取り、ゆっくりと2.5％にパスツールピペットでエキスを滴下塩化カルシウム（CaCl _2）溶液（w / v）の。
注：抽出されたEPSプロパティを構成するイオン性ハイドロゲルがある場合、ドロップ状（球状）ビーズが形成されます。抽出されたEPSは、プロパティを形成イオン性ハイドロゲルを持っていない場合、抽出物は、 _塩化カルシウム溶液中に分散します。

イオン性ハイドロゲルの4安定性試験

注：さらにAGS構造形成におけるイオンEPSヒドロゲルの役割を理解するために、安定性試験はステップ3.2に収集_し、Na ₂ CO ₃抽出のイオン性ハイドロゲルビーズで行いました。

CaCl ₂溶液中で30分間ハイドロゲルビーズを保管してください。
CaCl ₂からのハイドロゲルビーズを取り出すためにスプーンを使用して
10ミリリットルに保管画分1〜4℃で4時間脱塩水。
1.5 - 抽出法1.3に記載したように以下の安定性試験は、同じ様式で行いました。
4℃で3時間、EDTA溶液（w / v）のストアフラクション2 2 10mlの中で％。
7.15ミリリットルに保管して画分3、4℃で1時間60μlの99％ホルムアミド脱塩水。その後、4℃で3時間、2.85ミリリットルの1M NaOHおよび店舗画分3を追加します。
7.15ミリリットルに保管して画分4 4°Cで1時間60μlの37％ホルムアルデヒド脱塩水。その後、4℃で3時間、2.85ミリリットルの1M NaOHおよび店舗画分4を追加します。
ビーズは、抽出条件に耐えるかどうかを評価するために4.6から4.3に記載された条件の下で貯蔵中のビーズの目に見える崩壊があるかどうかを監視。

Representative Results

EPS抽出
異なるEPS抽出手順を適用した後、顆粒の外観は、図1に示されている。顆粒状、ゲル構造を遠心分離（ 図1a）およびEDTA抽出（ 図1c）の後に無傷でした。顆粒は超音波処理によって、異なるサイズの断片に分割されました。濁度は非常に遠心分離した後に減少したように、液相中の濁度が原因で小さな断片（ 図1b）の懸濁液にある可能性があります。ホルムアミドおよびホルムアルデヒド単独顆粒の形状およびそのゲル構造を変化させることに影響を及ぼさなかった（データは示さず）。 NaOHを添加した後、液相、黄色になりました。いくつかの綿毛状の物質は、顆粒の表面から剥離し、落ち着いた顆粒（ 図1d及び1eの ）の上に層を形成しました。それでも、の形状顆粒は変更されませんでした。 NaOHの添加は、明らかEPS可溶化を改善したが、ゲルマトリックスの構造に損傷を与えることができませんでした。比較では、顆粒は完全のNa ₂ CO ₃の抽出（ 図1F）の後に姿を消しました。代わりに、ゾル状の液体及び小さなゼリー状粒子の混合物は、実際に可溶化された顆粒のゲルマトリックスを示し、形成されました。

図1.好気性グラニュール汚泥のEPS抽出。顆粒上の各抽出法の影響をより見やすくするために、実験を25ミリリットルのガラス瓶中で行いました。抽出操作後、抽出物を浮遊物が沈降することを可能にするために室温で1時間維持しました。 （a）は、遠心分離、抽出、（b）は超音波処理抽出、（c）の EDTA抽出、（d）のホルムアミド- NaOHを余分ction、（e）のホルムアルデヒド-のNaOH抽出、（f）は、高温- 。のNa ₂ CO ₃の抽出この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

各方法のVS画分に対するEPSの収率は、図2に示されている。収量は_顆粒 VSグラム初期あたり_EPS VS MGに示されています。ホルムアルデヒド+のNaOHにより得られたEPSの量は、ホルムアミド+のNaOHおよびNa ₂ CO ₃ +熱+混合、遠心分離、超音波処理及びEDTA抽出よりも高かったです。アルカリ性条件は、EPS溶解^26,27を強化^することを示す^13,15 ^-これらの抽出技術についての同様の結果は、以前の研究¹¹で示されました。 Na ₂ CO ₃によって回収されたEPSの量唯一の遠心分離により得られたものの20倍以上、最高でした。さらに、 _の Na ₂ CO ₃抽出の合計EPS収率はさらに、複数の抽出によって増強することができます。最初の抽出のステップ1.6.8（プロトコルセクション）で廃棄されたペレットを用いて第2の抽出は、四重抽出があっても46％、総収量を増加し、28％の合計収率が増加しました。

図VS収率および灰分に対するすべての抽出方法の2。結果。それぞれについては、最初のバーは_顆粒 VSグラムの初期mg当たりVS _EPSにおけるVS収率を表し抽出。第二のバーは、抽出されたTS中の灰分の重量百分率を表します。エラーバーは、各抽出技術に行った3回の抽出の標準偏差を示します。"_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

アルギン酸塩のような細胞外ポリマー（ALE）の抽出
Na ₂ CO ₃抽出によって抽出されたEPSのpHを2.2に調整した後、合計VSの63％を沈殿させました。沈殿物は、酸性ALE ²⁵です。残留画分を抽出条件の下で可溶化することができる可能性が高いEPSだったが、pHは2.2で沈殿物を形成することはできません。

イオン性ヒドロゲル形成試験
好気性顆粒はヒドロゲルと類似していると記載されています。造粒工程は、ゲル化剤^4,9,25,28などの配糖体でゲル形成現象と考えられてきました。通常は、Ca ^2+が排水中の最も一般的なカチオンの一つです。また、それは容易に酸性多糖類と結合する（ 例えば、おそらく、対イオンとしてのアルギネートおよびポリガラクツロン酸）、ゲル^29を媒介します。こうしてイオン架橋ヒドロゲルが得られます。それは、Ca ²⁺イオンの添加は、好気性汚泥造粒^30を加速することができることが観察されました。したがって、のCa ²⁺ -EPS（イオン性ヒドロゲル）は、好気性粒状スラッジ中のゲルマトリックス構造を構築する上で重要な役割を果たすことができます。この点において、抽出されたEPSかを抽出したEPSは、好気性粒状スラッジ⁹中のゲルマトリックスの形成に寄与し、構造ポリマーであるかどうかを確認するためのテストとして使用できるのCa ²⁺イオンとのイオン性ヒドロゲルを形成します。

本研究では、様々な方法によってAGS（ 図3a）から抽出されたEPSのために、のNa ₂ CO ₃で抽出された唯一のEPSは（w / v）の_塩化カルシウム溶液中2.5％液滴の形状を保持し、安定したイオン性ハイドロゲルビーズを形成しました。また、このから得られたナトリウムALEは、追加のステップ（ALEポリマー抽出、 図3b）も同様に同じプロパティを表示することによりEPS。 Ca ²⁺ -ALEゲルビーズ（ 図3c）の色と形態は、好気性粒状スラッジ（ 図3a）に似ています。どうやら、のNa ₂ CO ₃の方法により抽出されたEPSは、好気性粒状スラッジ中のゲルマトリックスの形成に寄与する。このEPSの主成分であるALEは、イオン性のヒドロゲルを形成することができる構造のポリマーです。

イオン性ハイドロゲルの安定性試験
これは、EPSの抽出の間、好気性顆粒EDTA、ホルムアルデヒド+ NaOHおよびホルムアミド+ NaOHを（ 図1）にその球状の形状を維持することが観察されました。抽出された構造ポリマーが顆粒の安定性に役割を果たしている場合に理解するために、 ^の Ca ²⁺ -ALEビーズがありました抽出中に好気性顆粒とまったく同じように扱わ。興味深いことに、のCa ²⁺ -ALEビーズはAGSのものと同様の安定性を示した（ 図3d - 3F）、 すなわち 、のCa ²⁺ -ALEビーズはEDTAで非常に安定していました。 Ca ²⁺ -ALEビーズは、ホルムアルデヒド+ NaOHおよびホルムアミド中に浸漬されていたときのCaの表面から離脱し、ALEの少量²⁺ -ALEビーズ（ 図3Eに小さな茶色がかったフロックと3fが ）3時間+ NaOHであったが、、それぞれ。 Ca ²⁺ -ALEビーズと好気性顆粒間の安定性の点で、この類似性は、ALEはAGSゲルマトリックスを形成する重要な構造ポリマーの一部であることを示しています。

図3.好気性顆粒およびALEを抽出した。（a） の脱塩水PRに顆粒をIOR抽出。 4,000×gで遠心分離し、20分間4°Cの後（段落1.6および2に従って抽出）（b）の酸性ALE。イオン性ハイドロゲルの安定性試験の結果。 （C） ^の Ca ²⁺ -ALEビーズは4℃で4時間脱イオン水中に保存しました。 （D） ^の Ca ²⁺ -ALEビーズは、4℃で3時間、2％EDTAに格納されています。 （E） ^の Ca ²⁺ -ALEビーズは4℃で4時間のNaOH +ホルムアミドに格納されています。 （f）は 4°Cで4時間ホルムアルデヒド+ NaOH中に保存され^た Ca ²⁺ -ALEビーズを。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

プロトコルセクションの備考
EPS / ALEの抽出を50mlの体積および顆粒3gのために記載されています。これらの値は指針として意図されています。高い顆粒濃度の抽出は、抽出されたEPSの収量を減少させることができます。 ALEの抽出中に温度を30分間80℃に一定に維持されるべきです。加熱するために混合するのに必要な時間（約5分）プロトコルに含まれています。また、抽出効率は、フラスコ底部の直径と同じ大きさの磁気撹拌棒を用いて強化されます。これは、EPSの抽出を促進し、良好な混合特性及び粉砕効果をもたらすであろう。

その後プロトコルセクションで、すべての抽出（ステップ1.1から1.6で回収した上清）のTSとVS収率が決定されます。透析は、抽出に使用される化学物質の存在によるエラーの可能性を減少させる前にTSとVS測定を行う必要があります。 A3500ダのMWCOは、透析バッグ内のEPSの高分子を保持しながら、これらの化学物質を除去することをお勧めします。透析バッグは、抽出物の体積よりも大きな体積を有していなければなりません。抽出物の量は、（最大40％の体積増加にEDTAを抽出するため、例えば ）透析中に増加するので、これは、必要です。透析による化学的除去の程度は、前及び透析後のサンプルのpHを測定することによって決定することができます。代替として、透析水の導電率の測定は、イオン除去の程度を示します。

総抽出EPSからALEを得るためには、（1.6ステップ2）透析工程は任意です。それにもかかわらず、透析三の利点を有している：それは沈殿のために必要とされるHClの量を減少させる、その抽出物中の酸性物質移動を向上させ、得られたALEの灰分含有量を減少させます。 ALEの沈殿のためには、extracよりもはるかに大きい容量のガラスビーカーを使用することをお勧めしますトン。 Na ₂ CO _{3の場合は}通常_、抽出に過剰投与されています。試料は発泡に、前に透析されなかった場合、最初のNa ₂ CO ₃と反応する追加のHClを、二酸化炭素の形成をもたらす、抽出物中に放置し。 HClの添加の際に、抽出物は、ビーカーの底部と同じ大きさの磁気撹拌棒を用いてゆっくりと攪拌されるべきです。このサイズと低速攪拌の攪拌棒があっても沈殿物の構造を壊すことなく混合になります。酸性ゲル塊が抽出物中に形成されている場合は、ビーカーを手でわずかに旋回する必要があります。沈殿は、依然として、サンプル中の酸の均一な分布を得ながら抽出物の大量の増加を回避するために、1 Mの酸濃度を用いて行われます。より高い酸濃度は、地域のpH低下と酸性のゲル塊形成をもたらすことができます。 2.0より低いpHは、おそらく構造的な変化に、回収することができるALEの量を減少させます低いpHでのポリマー。 2.20±0.05で、最終pHを維持することが重要です。

制限事項
ALEの抽出方法は、一般に、AGS又はバイオフィルムからEPSの構造細胞外ポリマーを抽出することを目的とし、すべての現在EPSを抽出するように意図されていません。すべてのEPSを抽出するために、複数の抽出方法の組み合わせが必要です。また、ダブル、4人の抽出を適用することにより、VS _EPS収量の増加で示すように、一つの抽出は、全ての構造EPSを抽出しません。 ALE抽出は熱とアルカリ条件下で一定の混合を組み合わせ、過酷なEPS抽出法です。この理由のため、いくつかの細胞内物質がEPSと共に抽出されることが可能です。細胞溶解は、物理的および化学的抽出技術（超音波処理^31,32、NaOHを^31,32、EDTA ^11,32、CER ^32、熱³²及び高せん断速度mだけが原因で発生することができますが^19）ixing回収EPSにおける細胞内物質の存在は、まだ検証される必要があります。回収されたEPSは、細胞内物質を分析しなかった含まれているかどうかを抽出したEPSのイオン性ゲル形成性は、この研究の主な焦点です。今後の研究では、抽出されたEPSに細胞内物質を特定することに焦点を当てます。

AGSのヒドロゲルマトリックスを可溶化することは構造的なEPSを抽出することが重要です
EPSは、AGSで密でコンパクトなハイドロゲルマトリックスを形成します。 EPSは、それらのすべてではない多糖類、タンパク質、核酸、（リン）脂質、腐植物質および一部の間ポリマー^7,5,8、などの有機高分子の様々なクラスが含まれていますが、ゲルを形成します。のみがゲル形成ポリマーは、ここEPSの構造ポリマーとして考えられています。

EPS抽出の目的は、最初のEPSを可溶化するために、次に可溶化EPSを収集することです。構造EPS（ すなわち、トン場合彼）は、ヒドロゲルを形成することAGSのゲルマトリックスを最初に可溶化されなければならない抽出の対象であるEPS。ゲルマトリックスを可溶化することができる唯一の方法は、構造的EPSを抽出することが可能です。本研究では、このような遠心分離¹⁰のようないくつかの頻繁に使用されるEPS抽出法^- ^15、超音波処理^{10,14,15、EDTA} ¹⁰ ^- ^12,14,15、ホルムアルデヒド+ NaOHの^{^¹⁰から15}とホルムアミド+ NaOHの^13を効率的^に構造的に分離することができませんでしたEPS。これは、好気性顆粒のヒドロゲルマトリックスは、これらの方法によって可溶化されなかったという事実によるものです。このため、セクション4における安定性試験のみEDTA、ホルムアミド+ NaOHおよびホルムアルデヒド+ NaOHを抽出中に存在する条件で実施しました。これらの3回の抽出は、構造EPSを単離することができなかったが、それでものNa ₂ CO ₃抽出のほかに最高VS _EPS収率を得ました。条件OFのNa ₂ CO ₃抽出は、明らかにAGS行列を可溶化し、この抽出方法として適用されませんでした。したがって、安定性試験の間に適用される条件は、代表的と考えられました。

CERとEPS抽出に関するこれまでの研究では、ここで使用される化学抽出よりも良い結果を得られなかったとして、陽イオン交換樹脂（CER）で抽出し、別の頻繁に使用されるEPS抽出方法は、この比較のために考えられませんでした。

AGSにおけるゲル形成EPS
ゲル形成EPSはAGSのヒドロゲルマトリックスの構造EPSとして考えられています。このようなイオン性ゲル、温度によるゲル及びpH誘発性ゲルなどのヒドロゲルの様々な種類があることを指摘する価値があります。本研究では、イオン性ゲルを形成EPSに焦点を当てています。抽出された構造のゲル材料の大部分については、これは支配的な構造上のEPSである可能性が高いです。可能性EPSの他の種類は確かにあります。そのフォームヒドロゲルの異なる種類（ 例えば 、pH誘発されるゲル^28）は、好気性顆粒の同じまたは他のタイプの中に存在します。それにもかかわらず、関係なくヒドロゲルの種類は、EPSゲルマトリックスは、ゲル形成EPSを抽出するための最も重要なステップである可溶化、標的にされていません。

現在、ほとんどの研究は、グラニュール汚泥の構造EPSに行われています。このプロトコルに記載ALE抽出はAGSからゲル形成EPSを抽出することができ、構造的EPSを特徴付けるために、将来の研究に使用されます。さらなる研究は、より良好な造粒及びEPSのプロセスおよび機能を理解するためにAGS、構造的EPSおよび非構造EPSで行われる必要があります。微生物はEPSの正確な組成であり、どのようにEPSの組成物は、環境の変化に応じて変更されているものEPSのような大規模な量を生成する理由：特に以下の3点を検討する必要があります。関連するすべての化合物およびそれらのinteractiの検出と分析アドオンは、バイオフィルムとどのように我々の利点にそれらを使用するを理解するのに役立ちます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 ml baffled flask	Kimble	25630-250
1,000 ml glass beaker	VWR	213-1128
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer	IKA	3810000
sodium carbonate decahydrate	Merck KGaA	1063911000
50 ml centrifugation tubes	greiner bio-one	227261
Multifuge 1 S-R, centrifuge	Heraeus/Thermo Scientific	-
hydrochloric acid, 37%	Sigma-Aldrich	30721-1L-GL-D
250 ml glass beaker	VWR	213-1124
calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	1023821000
1 ml Pasteur Pipette	Copan	201C