Summary
Protokollet ger en metod för att lösa aerob granulärt slam i syfte att utvinna alginat liknande extracellulära polymerer (ALE).
Introduction
Under de senaste åren aeroba granulärt slam (AGS) processen har blivit en populär biologisk avloppsrening process, med framgång tillämpas på flera avloppsreningsverk fullskaleanläggningar 1. I motsats till det konventionella aktivslamprocessen, i AGS behandla mikroorganismerna bildning av granuler istället för flockarna 2. Dessa granuler har bättre sedimente, klarar högre organisk last priser, och har högre tolerans mot toxicitet än aktivslam flockar 3.
Till skillnad från biofilmer, är AGS bildas spontant utan inblandning av någon bärarmaterial 4. I AGS, liksom i biofilmer, mikroorganismer producerar en betydande mängd av höggradigt hydratiserade extracellulära polymera substanser (EPS) 5 för att bilda en hydrogel matris där de är själv immobiliserad 4-6. EPS är en komplex blandning, som består av polysackarider, proteiner, nukleinsyror, (phospho) lipider, humusämnen och vissa interpolymerer 5,7,8. Dessa polymera ämnen interagerar med varandra via elektrostatiska krafter, vätebindningar, attraktiva joniska krafter och / eller biokemiska reaktioner, etc. 5, som bildar en tät och kompakt tertiär nätverksstruktur. Polymererna i EPS som kan bilda hydrogeler 4,9 och bidra till bildandet av den tertiära nätverksstrukturen är i detta avseende betraktas som strukturella EPS, en delmängd av den totala EPS.
EPS är ansvariga för den kemiska strukturen och de fysikaliska egenskaperna hos granulat 5. Det är därför viktigt att förstå funktionen hos varje EPS förening. Olika metoder används för att extrahera EPS 10-15. Men på grund av att de är extremt komplicerade, är det nästan omöjligt att extrahera alla EPS komponenter genom en enda metod. Hittills finns det ingen "one size fits all" metod för EPS utvinning. Valet av extraktionsmetod påverkar inte bara den totala mängden, men också sammansättningen av de återvunna polymerer 13,16 - 20. Beroende på vilken typ av slam och EPS intressanta olika metoder krävs.
Extrahera gelbildande polymerer, som kännetecknar deras egenskaper och undersöka deras interaktioner med varandra och med icke-gelbildande EPS kommer att bidra till att avslöja roll EPS i aerob formation granulärt slam. Vidare är de gelbildande polymererna är också användbara biopolymerer i industriella tillämpningar. En möjlig tillämpning var redan visats genom användning av gelbildande polymerer från AGS som ett beläggningsmaterial för att öka vattenbeständigheten hos papper 21.
Därför behövs extraktionsmetoder, specifika för gelbildande EPS. Syftet med denna studie är att utveckla en metod för att utvinna gelbildande EPS från AGS. Sex extraktionsmetoder 10-15,22, som ofta används i litteraturen, valdes för att extrahera EPS från AGS. Det totala beloppet och gelbildande egenskap hos de extraherade EPS jämfördes för varje metod.
Protocol
OBS: AGS samlades från pilotreaktorn Nereda vid avloppsreningsverket Utrecht, Nederländerna. Reaktorn matades med kommunalt avloppsvatten. Det granulära slammet hade en volym slamindex (SVI 5min) av 59,5 ml / g VSS. Slammet samplades i April vid slutet av en aerob cykel. Efter provtagning, fick slammet transporterades omedelbart till laboratoriet, siktades och lagrades vid -20 ° C fram till användning.
1. EPS Extraktion
OBS: Centrifugera granulärt slam vid 4000 x g och 4 ° C under 20 min och dekantera supernatanten. Samla granulat i pelleten för extraktioner. De totala fasta ämnen (TS) och flyktiga fasta ämnen (VS) av granulerna bestämdes med de standardmetoder 23. Omvandlingsfaktorn mellan granulat våtvikt - vikten av granulerna tagna direkt från pellets - och TS bestämdes före extraktion. Alla extraktioner gjordes i tre exemplar.
OBS: 3 g våt granules användes för varje utvinningsmetod. Deras TS och VS-värden (0,39 g TS och 0,34 g VS), mätt i triplikat, användes för att beräkna extraktionsutbytet.
- Centrifugering extraktion 11
- Överföring 3 g (våt vikt) av granulerna in i ett centrifugrör och fylla upp centrifugrör till 50 ml med avmineraliserat vatten.
- Något skaka centrifugrör hand.
- Centrifugera centrifugrör innehållande blandningen vid 4000 x g och 4 ° C under 20 min.
- Samla upp supernatanten i en glasbägare, kasta pelleten och fortsätta med supernatanten som beskrivs i avsnitt 1.7.
- Sonikering extraktion 10
- Överföring 3 g (våt vikt) av granulerna in i ett centrifugrör och fylla upp centrifugrör till 50 ml med avmineraliserat vatten.
- Applicera pulsad ultraljudsbehandling på is under 2,5 min vid 40 W till blandningen.
- Centrifugera centrifugerrör innehållande av blandningen vid 4000 x g och 4 ° C under 20 min.
- Samla upp supernatanten i en glasbägare, kasta pelleten och fortsätta med supernatanten som beskrivs i avsnitt 1.7.
- Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) extraktion 11
- Överföring 3 g (våtvikt) av granuler i en 100 ml glasflaska och fylla upp flaskan till 50 ml med 2% (vikt / volym) EDTA-lösning.
- Något skaka flaskan för hand och förvara den i kylskåp vid 4 ° C under 3 timmar.
- Överför blandningen in i en 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera centrifugrör innehållande blandningen vid 4000 x g och 4 ° C under 20 min.
- Samla upp supernatanten i en glasbägare, kasta pelleten och fortsätta med supernatanten som beskrivs i avsnitt 1.7.
- Formamid - natriumhydroxid utvinning (NaOH) 13
- Överföring 3 g (våt vikt) av granulerna in i en 100ml glasflaska och fylla upp flaskan till 50 ml med avmineraliserat vatten.
- Lägg 0,3 ml 99% formamid.
- Något skaka flaskan för hand och förvara den i kylskåp vid 4 ° C under 1 timme.
- Tillsätt 20 ml 1 M NaOH till granulen suspensionen.
- Något skaka flaskan för hand och förvara den i kylskåp vid 4 ° C under 3 timmar.
- Överför blandningen jämnt i två 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera centrifuge rör innehållande av blandningen vid 4000 x g och 4 ° C under 20 min.
- Samla upp supernatanten i en glasbägare, kasta pelleten och fortsätta med supernatanten som beskrivs i avsnitt 1.7.
- Formaldehyd - NaOH extraktion 11
- Överföring 3 g (våtvikt) av granuler i en 100 ml glasflaska och fylla upp flaskan till 50 ml med avmineraliserat vatten.
- Lägg 0,3 ml 37% formaldehyd.
- Något skaka flaskan för hand och lagraden i kylskåp vid 4 ° C under 1 timme.
- Tillsätt 20 ml 1 M NaOH till granulen suspensionen.
- Något skaka flaskan för hand och förvara den i kylskåp vid 4 ° C under 3 timmar.
- Överför blandningen jämnt i två 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera centrifuge rör innehållande av blandningen vid 4000 x g och 4 ° C under 20 min.
- Samla upp supernatanten i en glasbägare, kasta pelleten och fortsätta med supernatanten som beskrivs i avsnitt 1.7.
- Hög temperatur - natriumkarbonat utvinning (Na 2 CO 3) 9,22,24
- Förvärmning 150 ml kranvatten i en 1000 ml glasbägare på en magnetomrörare till 80 ° C.
- Överföring 3 g (våtvikt) av granulat i en 250 ml bafflad kolv och fyll upp kolven till 50 ml med avjoniserat vatten.
- Lägga 0,25 g Na 2 CO 3 vattenfri eller 0,67 g Na 2 CO 3 • 10H
- Sätt kolven innehållande blandningen i vattenbad. Täck kolven och bägaren glaset separat med aluminiumfolie för att förhindra avdunstning.
- Rör om blandningen under 35 min vid 400 rpm och 80 ° C.
- Överför blandningen in i en 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera centrifugrör innehållande blandningen vid 4000 x g och 4 ° C under 20 min.
- Samla in supernatanten och kasta pelleten.
- TS och VS mätning av alla extrakt i enlighet med de standardmetoder 23.
- Ta supernatanten och dialysera det för 24 timmar mot 1000 ml ultrarent vatten (dialyspåse med 3500 Da molekylvikt avskurna (MWCO)) 11,12. Ändra dialys vatten efter 12 timmar för att öka effekten av dialysen.
- Överför en rimlig del (cirka 1/3) av dialysvätskan tillen aluminiumskål för TS och VS mätning 23.
OBS: Torka provet över natten vid 105 ° C. Viktskillnaden hos den tomma aluminiumskål och aluminiumskål innehållande det torkade provet är TS-halt. Sedan bränna samma aluminiumskål innehållande provet vid 550 ° C under 2 h. Viktskillnaden mellan den tomma aluminiumskål och aluminiumskål innehållande det brända provet är askhalten. Skillnaden mellan TS och askhalten är VS innehåll. - För varje extrakt, överföra den resterande fraktionen av den dialyserade supernatanten till 10 ml glasbägare. Tjockna supernatanten under 2 dagar vid 60 ° C till en slutlig volym av 1-2 ml för att öka polymerkoncentrationen i supernatanten.
2. Alginat-liknande extracellulärt Polymer (ALE) Utvinning
- Dialysera extraktet som erhållits i steg 1.6.8 enligt steg 1.7.1.
- Överföra den dialyserade extraktet in i en 250 ml glasbägare. Långsamly rör utvinning vid 100 rpm och rumstemperatur. Ständigt övervaka pH-förändringar med en pH-elektrod, under tillsats av 1 M saltsyra (HCl) till ett slutligt pH av 2,2 ± 0,05 för att erhålla ALE i den sura formen.
- Efter justering av pH till 2,2, överföra extraktet till ett 50 ml centrifugrör och centrifugera vid 4000 x g och 4 ° C under 20 min.
- Kassera supernatanten och samla det gelliknande pelleten. Det gelliknande pelleten är ALE i den sura formen.
- För att erhålla natrium (eller kalium) form av ALE, långsamt 0,5 M NaOH (eller 0,5 M kaliumhydroxid) till gelén erhållen i steg 2,4, medan blanda gel långsamt med ett glas pinne för hand tills pH 8,5 uppnåtts.
3. Ionic Hydrogel Formation Test
OBS: För att kontrollera om de extraherade EPS hade joniska hydrogel formationsegenskaper, en pärla formation provning med Ca2 + joner användes 25.
- Efter förtjockning av extraktet i steg 1.7.3 tillen volym av 1-2 ml, långsamt rör blandningen med en glas pinne och justera dess pH till 8,5 med 0,5 M NaOH.
- Ta extraktet från steg 3,1 eller natrium ALE i steg 2,5 och långsamt droppa extraktet med en pasteurpipett i en 2,5% (vikt / volym) kalciumklorid (CaCl2) lösning.
OBS: Om det extraherade EPS har jonisk hydrogel gelbildande egenskaper, droppformade (sfäriska) pärlor kommer att bildas. Om det extraherade EPS har ingen jonisk hydrogel gelbildande egenskaper, kommer extraktet löses upp i den CaCl2 lösning.
4. Stabilitetstest av den joniska hydrogel
OBS: För att ytterligare förstå rollen av joniska EPS hydrogel i AGS strukturbildning, har stabilitetstester utfördes på de joniska hydrogelsträngarna av Na 2 CO 3 utvinning, som samlats in i steg 3,2.
- Hålla hydrogelsträngarna under 30 minuter i CaCl2-lösningen.
- Använda en sked för att ta ut hydrogelsträngarna från CaCl2
- Store fraktion 1 i 10 ml avmineraliserat vatten under 4 h vid 4 ° C.
Följande stabilitetstester utfördes på samma sätt som beskrivits i de extraktionsmetoder 1,3 - 1,5. - Store fraktion 2 i 10 ml 2% (vikt / volym) EDTA-lösning under 3 h vid 4 ° C.
- Store fraktion 3 i 7,15 ml avmineraliserat vatten med 60 pl 99% formamid under 1 timme vid 4 ° C. Tillsätt sedan 2,85 ml 1 M NaOH och lagra fraktion 3 under 3 h vid 4 ° C.
- Store fraktion 4 i 7,15 ml avmineraliserat vatten med 60 pl 37% formaldehyd under en timme vid 4 ° C. Tillsätt sedan 2,85 ml 1 M NaOH och lagra fraktion 4 under 3 h vid 4 ° C.
- Övervaka om det finns synlig sönderdelning av pärlorna under lagring under de förhållanden som beskrivs i 4,3-4,6 för att utvärdera om pärlorna motstå extraktionsbetingelser.
Representative Results
EPS extraktion
Utseendet av granuler efter applicering olika EPS extraktionsförfaranden visas i figur 1. Formen och gelstrukturen av granuler var intakta efter centrifugering (Figur 1a) och EDTA-extraktion (fig 1c). Granuler bröts i fragment av olika storlekar genom ultraljudsbehandling. Grumligheten i vätskefasen kan bero på upphävandet av små fragment (Figur 1b) som grumligheten minskade kraftigt efter centrifugering. Formamid och formaldehyd ensam inte hade någon inverkan på att förändra formen på granulat och dess gelstruktur (data visas ej). Efter tillsatsen av NaOH, vände den flytande fasen gulaktig. Några fluffigt material lösgjordes från ytan av granulerna och bildade ett skikt ovanpå de sedimente granuler (figur 1d och 1e). Fortfarande, formen pågranulat ändrades inte. Tillsatsen av NaOH synes förbättrade EPS upplösningen, men kunde inte skada gelmatrisen strukturen. I jämförelse, granulat helt försvunnit efter Na 2 CO 3 extraktion (figur 1F). I stället en blandning av sol-liknande vätska och små geléliknande partiklar bildades, visar gelmatrisen av granulat var faktiskt upplöst.
Figur 1. Aerobic granulär slam EPS extraktioner. För en bättre visualisering av effekterna av varje extraktionsmetod på granulerna, experiment genomfördes i 25 ml glasflaskor. Efter extraktionen förfarande, extrakten hölls under 1 timme vid rumstemperatur för att tillåta suspenderat material sedimentera. (A) Centrifugering extraktion, (b) Sonication extraktion, (c) EDTA-extraktion, (d) Formamid - NaOH extraInsatser (e) Formaldehyd - NaOH extraktion, (f) Hög temperatur -. Na 2 CO 3 extraktion klicka god här för att se en större version av denna siffra.
EPS utbyte med avseende på VS-fraktionen för varje metod illustreras i figur 2. Utbytet presenteras i mg VS EPS per g ursprunglig VS granul. Mängden EPS erhållna genom formaldehyd + NaOH, formamid + NaOH och Na 2 CO 3 + värme + blandning var högre än den för centrifugering, sonikering och EDTA-extraktion. Liknande resultat för dessa utvinningstekniker visades också av tidigare undersökningar 11 - 13,15 indikerar att alkaliska betingelser öka EPS löslighet 26,27. Mängden EPS utvanns genom Na 2 CO 3 var den högsta, mer än 20 gånger av den som erhålles endast genom centrifugering. Dessutom kan den totala EPS utbytet av Na 2 CO 3 extraktionen ökas ytterligare genom flera extraktioner. En andra extraktion med pelleten kasseras i steg 1.6.8 (protokollenheten) i den första extraktionen ökade det totala utbytet med 28%, en fyrdubbel extraktion ökade även den totala avkastningen med 46%.
Figur 2. Resultat av alla utvinningsmetoder med avseende på VS avkastning och askhalt. För varje extraktion det första strecket representerar VS utbytet i mg VS EPS per g initial VS granulat. Den andra stapeln representerar viktprocenten av aska i de extraherade TS. Felstaplarna visar standardavvikelsen för de tre extraktioner utförs för varje extraktion teknik."_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Alginat-liknande extracellulära polymer (ALE) extraktion
Efter att pH av de EPS extraherats med hjälp av Na 2 CO 3 extraktionen justerades till 2,2, var 63% av den totala VS utfälldes. Fällningen är sura ALE 25. Återstodsfraktion var troliga EPS, som kan solubiliseras under extraktionsbetingelser, men kan inte bilda en fällning vid pH 2,2.
Jonisk hydrogel formation testet
Aeroba granuler har beskrivits såsom varande liknar en hydrogel. Granuleringsprocessen har betraktats som ett gelbildande fenomen med glykosider som gelningsmedlet 4,9,25,28. Normalt är Ca2 + ett av de vanligaste katjoner i avloppsvatten. Dessutom lätt binder den med sura polysackarider (t.ex.,alginat och poly-galakturonsyra), förmodligen som en motjon att förmedla gelning 29. Sålunda resulterar i en joniskt tvärbunden hydrogel. Det observerades att tillsats av Ca2 + -joner kan påskynda aerob slam granulering 30. Därför Ca2 + -EPS (jonisk hydrogel) skulle kunna spela en viktig roll i att bygga upp gelmatrisen strukturen i aerob granulärt slam. I detta avseende, oavsett de extraherade EPS bildar en jonisk hydrogel med Ca2 + -joner skulle kunna användas som ett test för att kontrollera om den extraherade EPS är en strukturell polymer som bidrar till bildandet av gelmatrisen i aerob granulärt slam 9.
I denna forskning, för EPS extraherats från AGS (figur 3a) genom olika metoder, bara EPS extraherade av Na 2 CO 3 höll formen av en droppe i 2,5% (w / v) CaCl2-lösning och bildade stabila joniska hydrogelsträngar .Dessutom natrium ALE erhållits från denna EPS genom ytterligare steg (ALE polymerutvinning, Figur 3b) visas samma egendom samt. Färgen och morfologi av Ca2 + -ALE gelpärlor (Figur 3c) liknar aerob granulärt slam (figur 3a). Tydligen EPS extraherats med hjälp av Na 2 CO 3 metod bidrar till bildandet av gelmatrisen i aerob granulärt slam. ALE, som är en huvudkomponent i denna EPS är strukturella polymerer, som kan bilda en jonisk hydrogel.
Stabilitetstest av den joniska hydrogelen
Det konstaterades att under EPS utvinning, aeroba granulat höll sin sfäriska form i EDTA, formaldehyd + NaOH och formamid + NaOH (Figur 1). För att förstå om de extraherade strukturella polymerer spelar en roll för stabiliteten hos granulerna, Ca var 2 + -ALE pärlorbehandlas på exakt samma sätt som aeroba granuler under extraktionen. Intressant, Ca2 + -ALE pärlor uppvisade liknande stabilitet som den i AGS (Figur 3d - 3f), det vill säga, Ca2 + -ALE pärlor var mycket stabil i EDTA. Det fanns liten mängd ALE loss från ytan av Ca2 + -ALE pärlor (liten brun flock i figur 3e och 3f), när Ca2 + -ALE pärlor hade dränkts i formaldehyd + NaOH och formamid + NaOH under tre timmar , respektive. Denna likhet i fråga om stabilitet mellan Ca2 + -ALE pärlor och aeroba granulat indikerar att ALE är en del av de viktiga strukturella polymerer bildar gelmatrisen AGS.
Figur 3. Aerobic granulat och extraherade ALE. (A) granulat i avsaltat vatten prior extraktion. (B) Acidic ALE (extraherat i enlighet med de punkterna 1.6 och 2) efter centrifugering vid 4000 x g och 4 ° C under 20 min. Resultaten av stabilitetstestet av den joniska hydrogelen. (C) Ca2 + -ALE-pärlor lagras i avmineraliserat vatten under 4 h vid 4 ° C. (D) Ca2 + -ALE-pärlor lagrades i 2% EDTA, under 3 h vid 4 ° C. (E) Ca 2+ -ALE-pärlor som är lagrade i formamid + NaOH under 4 h vid 4 ° C. (F) Ca 2 + -ALE-pärlor som lagras i formaldehyd + NaOH i 4 h vid 4 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Anmärkningar för protokollenheten
Extraktionen av EPS / ALE beskrivs för en volym av 50 ml och 3 g granulat. Dessa värden är avsedda som riktlinjer. Extraktioner med högre granulat koncentrationer kan minska utbytet av de extraherade EPS. Vid utvinning av ALE temperaturen bör hållas konstant vid 80 ° C under 30 min. Den tid som krävs för blandningen att värma upp (ca 5 min) är inkluderad i det protokollet. Vidare är extraktion effektivitet förbättras genom användning av en magnetisk omrörarstav av samma storlek som diametern för kolvens botten. Detta kommer att resultera i goda blandningsegenskaper och fräseffekter, främja extraktionen av EPS.
Senare i protokollet avsnittet är TS och VS utbyten av alla extraktioner (supernatant i steg 1,1-1,6) bestäms. Dialys måste utföras före TS och VS mätning för att minska eventuella fel på grund av förekomsten av kemikalier som används för extraktioner. enMWCO av 3500 Da rekommenderas att ta bort dessa kemikalier med bibehållen EPS makromolekyler inom dialyspåsen. Dialyspåsen bör ha en större volym än volymen av extraktet. Detta är nödvändigt, eftersom volymen av extraktet kommer att öka under dialys (t.ex. för EDTA utvinning upp till 40% volymökning). Omfattningen av kemisk avlägsnande genom dialys kan bestämmas genom mätning av pH i provet före och efter dialys. Alternativt konduktivitetsmätningar av dialys vatten visar omfattningen av jon borttagning.
För att erhålla ALE från den totala extraherade EPS (steg 1,6 och 2) dialys steg är valfritt. Icke desto mindre har dialys tre fördelar: det reducerar mängden av HCl behövs för utfällningen, det förbättrar syramassöverföring i extraktet och minskar innehållet i den erhållna ALE aska. För utfällning av ALE rekommenderas att använda en glasbägare med en mycket större volym än extract. Na 2 CO 3 normalt doseras i utvinning. Den sattes HCl kommer först reagera med Na 2 CO 3 kvar i extraktet, vilket resulterar i koldioxid bildning och, om provet inte dialyserades tidigare, i skumning. Under tillsatsen av HCl, bör extraktet omröras långsamt med en magnetisk omrörarstav av samma storlek som botten av bägaren. En omrörarstav av denna storlek och långsam omrörning kommer att resultera i jämn blandning utan att bryta strukturen hos fällningen. Om sura gel klumpar bildas i extraktet bör bägaren snurras lätt för hand. Utfällningen hålls med en syrakoncentration av 1 M för att undvika ett stort volymökning av extraktet medan man fortfarande erhåller en homogen fördelning av syran i provet. Högre syrakoncentrationer kan leda till en regional pH-sänkning och sura gel klumpar bildas. Ett pH lägre än 2,0 minskar mängden ALE som kan återvinnas, förmodligen på grund av strukturella förändringarav polymererna vid lägre pH. Det är därför viktigt att hålla den slutliga pH-värdet vid 2,20 ± 0,05.
begränsningar
ALE utvinning Metoden syftar till att utvinna strukturella extracellulära polymerer av EPS från AGS eller biofilmer i allmänhet och är inte avsedd att extrahera alla nuvarande EPS. För att extrahera alla EPS, är det nödvändigt med en kombination av mer än en extraktionsmetod. Dessutom, som visas med ökningen av VS EPS avkastning genom att tillämpa en dubbel och fyrdubbla utvinning, en enda extraktion kommer inte extrahera alla strukturella EPS. ALE extraktion är en hård EPS extraktionsmetod, kombinerar konstant blandning med värme och alkaliska betingelser. Av denna anledning är det möjligt att en del intracellulärt material extraheras tillsammans med EPS. Även cellys kan orsakas av fysiska och kemiska utvinningstekniker (ultraljudsbehandling 31,32, NaOH 31,32, EDTA 11,32, CER 32, värme 32 och hög skjuvhastigheter av mixing 19), måste närvaron av intracellulära material i återvunna EPS står att verifieras. Den joniska gelbildande egenskap hos de extraherade EPS är i fokus för denna forskning, om den återvunna EPS innehåller intracellulär material analyserades inte. Framtida forskning kommer att fokusera på att identifiera intracellulära materialet i de extraherade EPS.
Solubilisering hydrogelmatrisen AGS är avgörande för att utvinna strukturella EPS
EPS bildar en tät och kompakt hydrogel matris i AGS. Även om EPS innehåller olika klasser av organiska makromolekyler, såsom polysackarider, proteiner, nukleinsyror, (fosfo) lipider, humusämnen och vissa intercellulära polymerer 7,5,8, inte alla av dem bilda en gel. Endast de gelbildande polymerer här betraktas som strukturella polymerer i EPS.
Syftet med EPS extraktioner är att först lösa EPS och sedan samla de solubiliserade EPS. Om de strukturella EPS (dvs than EPS bildar en hydrogel) är målet för utvinning, har gelmatrisen av AGS som skall lösas först. Endast metoder som kan solubilisera gelmatrisen är kapabla att utvinna strukturella EPS. I denna forskning används EPS extraktionsmetoder såsom centrifugering 10 några vanliga - 15, sonikering 10,14,15, EDTA 10 - 12,14,15, formaldehyd + NaOH 10 - 15 och formamid + NaOH 13 kunde inte på ett effektivt sätt isolera strukturella EPS. Detta beror på det faktum att hydrogel-matrisen av de aeroba granulerna inte solubiliserades genom dessa metoder. Av denna anledning har stabilitetstester i avsnitt 4 endast utföras med omständigheterna i EDTA, formamid + NaOH och formaldehyd + NaOH extraktion. Dessa tre extraktioner var inte i stånd att isolera strukturella EPS, men ändå fått högsta VS EPS avkastning förutom Na 2 CO 3 extraktion. betingelser of Na 2 CO 3 extraktion har inte tillämpats som denna extraktionsmetod klart solubiliserade AGS matrisen. Därav de tillämpade förhållandena under stabilitetstestet ansågs vara representativa.
Extraktion med katjonbytarharts (CER), en annan ofta använd EPS extraktionsmetod, ansågs inte vara för denna jämförelse, som tidigare studier på EPS extraktion med CER inte gav bättre resultat än de kemiska extraktioner används här.
Gelbildande EPS i AGS
Gelbildande EPS betraktas som struktur EPS i hydrogel matris av AGS. Det är värt att påpeka att det finns olika typer av hydrogeler, såsom joniska geler, temperatur inducerade geler och pH inducerade geler. Denna studie fokuserar bara på EPS som bildar joniska geler. Beträffande stor del av struktur gelmaterial utvinns, är detta sannolikt att vara de dominerande strukturella EPS. Det finns säkert möjligheter som andra typer av EPSsom bildar olika typer av hydrogeler (t.ex. pH inducerade gel 28) finns i samma eller annan typ av aeroba granuler. Ändå, oavsett vilken typ av hydrogel är riktad, solubilisering EPS gelmatrisen är det viktigaste steget för att extrahera gelbildande EPS.
För närvarande har lite forskning gjorts på strukturella EPS granulärt slam. ALE extraktion beskrivs i detta protokoll är kapabel att extrahera gelbildande EPS från AGS och kommer att användas i framtida studier för att karakterisera struktur EPS. Mer forskning behöver göras på AGS, strukturella EPS och icke-strukturella EPS för att bättre förstå processen och funktion granulering och EPS. Särskilt följande tre punkter måste utredas: varför mikroorganismer producerar en så stor mängd av EPS, vad är den exakta sammansättningen av EPS och hur sammansättningen av EPS ändras beroende på miljöförändringar. Upptäcka och analysera alla berörda föreningar och deras interactions kommer att bidra till att förstå biofilmer och hur man använder dem till vår fördel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 ml baffled flask | Kimble | 25630-250 | |
| 1,000 ml glass beaker | VWR | 213-1128 | |
| RCT basic, magnetic stirrer with thermometer | IKA | 3810000 | |
| sodium carbonate decahydrate | Merck KGaA | 1063911000 | |
| 50 ml centrifugation tubes | greiner bio-one | 227261 | |
| Multifuge 1 S-R, centrifuge | Heraeus/Thermo Scientific | - | |
| hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 30721-1L-GL-D | |
| 250 ml glass beaker | VWR | 213-1124 | |
| calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 1023821000 | |
| 1 ml Pasteur Pipette | Copan | 201C |
References
- Pronk, M., de Kreuk, M. K., de Bruin, B., Kamminga, P., Kleerebezem, R., van Loosdrecht, M. C. M. Full scale performance of the aerobic granular sludge process for sewage treatment. Water Res. 84, 207-217 (2015).
- Kreuk, M. K., Kishida, N., van Loosdrecht, M. C. M. Aerobic granular sludge - state of the art. Water Sci. Technol. 55 (8-9), 75 (2007).
- Adav, S. S., Lee, D. J., Show, K. Y., Tay, J. H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnol. Adv. 26, 411-423 (2008).
- Seviour, T., Pijuan, M., Nicholson, T., Keller, J., Yuan, Z. Understanding the properties of aerobic sludge granules as hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 102 (5), 1483-1493 (2009).
- Flemming, H. -C., Wingender, J.
- Seviour, T., Yuan, Z., van Loosdrecht, M. C. M., Lin, Y. Aerobic sludge granulation: A tale of two polysaccharides? Water Res. 46 (15), 4803-4813 (2012).
- Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. -C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances. Microb. Extracell. Polym. Subst. Charact. Struct. Funct. , 27-53 (1999).
- Flemming, H. -C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS Matrix: The "House of Biofilm Cells.". J. Bacteriol. 189 (22), 7945-7947 (2007).
- Lin, Y. M., Sharma, P. K., van Loosdrecht, M. C. M. The chemical and mechanical differences between alginate-like exopolysaccharides isolated from aerobic flocculent sludge and aerobic granular sludge. Water Res. 47 (1), 57-65 (2013).
- Fang, H. H. P., Jia, X. S. Extraction of extracellular polymer from anaerobic sludges. Biotechnol. Tech. 10 (11), 803-808 (1996).
- Liu, H., Fang, H. H. P. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) of sludges. J. Biotechnol. 95, 249-256 (2002).
- Comte, S., Guibaud, G., Baudu, M. Effect of extraction method on EPS from activated sludge: An HPSEC investigation. J. Hazard. Mater. 140 (1-2), 129-137 (2007).
- Adav, S. S., Lee, D. J. Extraction of extracellular polymeric substances from aerobic granule with compact interior structure. J. Hazard. Mater. 154, 1120-1126 (2008).
- Pan, X., Liu, J., Zhang, D., Chen, X. I., Li, L., Song, W., Yang, J. A comparison of five extraction methods for extracellular polymeric substances (EPS) from biofilm by using three-dimensional excitation-emission matrix (3DEEM) fluorescence spectroscopy. Water SA. 36 (1), 111-116 (2010).
- D'Abzac, P., Bordas, F., Van Hullebusch, E., Lens, P. N. L., Guibaud, G. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) from anaerobic granular sludges: Comparison of chemical and physical extraction protocols. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1589-1599 (2010).
- Comte, S., Guibaud, G., Baudu, M. Relations between extraction protocols for activated sludge extracellular polymeric substances (EPS) and EPS complexation properties: Part I. Comparison of the efficiency of eight EPS extraction methods. Enzyme Microb. Technol. 38 (1-2), 237-245 (2006).
- Adav, S. S., Lee, D. J., Tay, J. H. Extracellular polymeric substances and structural stability of aerobic granule. Water Res. 42, 1644-1650 (2008).
- Caudan, C., Filali, A., Lefebvre, D., Spérandio, M., Girbal-Neuhauser, E. Extracellular polymeric substances (EPS) from aerobic granular sludges: Extraction, fractionation, and anionic properties. Appl. Biochem. Biotechnol. 166 (7), 1685-1702 (2012).
- Frølund, B., Palmgren, R., Keiding, K., Nielsen, P. H. Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin. Water Res. 30 (8), 1749-1758 (1996).
- Nielsen, P. H., Jahn, A.
- Lin, Y. M., Nierop, K. G. J., Girbal-Neuhauser, E., Adriaanse, M., van Loosdrecht, M. C. M. Sustainable polysaccharide-based biomaterial recovered from waste aerobic granular sludge as a surface coating material. Sustain. Mater. Technol. 4, 24-29 (2015).
- Lin, Y. M., Wang, L., Chi, Z. M., Liu, X. Y. Bacterial Alginate Role in Aerobic Granular Bio-particles Formation and Settleability Improvement. Sep. Sci. Technol. 43 (7), 1642-1652 (2008).
- Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , American Public Health Association. Washington DC. (1998).
- Mchugh, D. J. A guide to the seaweed industry. , FAO Fish. Tech. Pap. 441. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome, Italy. (2003).
- Lin, Y., de Kreuk, M., van Loosdrecht, M. C. M., Adin, A. Characterization of alginate-like exopolysaccharides isolated from aerobic granular sludge in pilot-plant. Water Res. 44 (11), 3355-3364 (2010).
- Zorel, J. A., Aquino, S. F., Sanson, aL., Castro-Borges, W., Silva, S. Q. Evaluation of EPS extraction protocols from anaerobic sludge for gel-based proteomic studies. Water Sci. Technol. 72 (4), 535 (2015).
- Ruiz-Hernando, M., Cabanillas, E., Labanda, J., Llorens, J. Ultrasound, thermal and alkali treatments affect extracellular polymeric substances (EPSs) and improve waste activated sludge dewatering. Process Biochem. 50 (3), 438-446 (2015).
- Seviour, T., Pijuan, M., Nicholson, T., Keller, J., Yuan, Z. Gel-forming exopolysaccharides explain basic differences between structures of aerobic sludge granules and floccular sludges. Water Res. 43, 4469-4478 (2009).
- de Kerchove, A. J., Elimelech, M. Formation of polysaccharide gel layers in the presenceof Ca2+ and K+ ions: Measurements and mechanisms. Biomacromolecules. 8 (1), 113-121 (2007).
- Jiang, H. L., Tay, J. H., Liu, Y., Tay, S. T. L. Ca2+ augmentation for enhancement of aerobically grown microbial granules in sludge blanket reactors. Biotechnol. Lett. 25 (2), 95-99 (2003).
- Liang, Z., Li, W., Yang, S., Du, P. Extraction and structural characteristics of extracellular polymeric substances (EPS), pellets in autotrophic nitrifying biofilm and activated sludge. Chemosphere. 81 (5), 626-632 (2010).
- Guo, X., Liu, J., Xiao, B. Evaluation of the damage of cell wall and cell membrane for various extracellular polymeric substance extractions of activated sludge. J. Biotechnol. 188, 130-135 (2014).
