طرق لعزل والثقافة، وتوصيف الوظيفي للالجيبية الأذينية عقدة Myocytes من الفئران الكبار
Summary
وأظهرت أساليب لعزل myocytes العقدة الجيبية الأذينية (صواريخ سام) من فئران بالغة لالمشبك التصحيح الكهربية أو التصوير الدراسات. الخلايا المعزولة يمكن استخدامها مباشرة أو يمكن حافظت في الثقافة للسماح التعبير عن البروتينات المثيرة للاهتمام، مثل صحفيين المشفرة وراثيا.
Abstract
myocytes العقدة الجيبية الأذينية (صواريخ سام) تكون بمثابة منظم ضربات القلب الطبيعية للقلب، والشروع في قلب كل فوز عن طريق توليد إمكانات العمل عفوية (الجزائرية). وتعكس هذه الصورة المتقدم جهاز تنظيم ضربات القلب والنشاط المنسق العديد من التيارات الغشاء والدراجات الكالسيوم داخل الخلايا. إلا أن الآليات الدقيقة التي تدفع النشاط تنظيم ضربات القلب عفوية في صواريخ سام لا تزال بعيدة المنال. تماما صواريخ سام معزولة هي إعداد ضروري لتجارب لتشريح الأساس الجزيئي للpacemaking القلب. ومع ذلك، فإن التشريح غير واضحة، تسليخ مجهري معقد، وصعب ظروف الهضم الأنزيمية حالت دون انتشار استخدام صواريخ سام معزولة تماما. وبالإضافة إلى ذلك، كانت الطرق غير متوفرة حتى وقت قريب للسماح الثقافة على المدى الطويل من صواريخ سام للدراسات تعبير البروتين. هنا نقدم خطوة بخطوة بروتوكول والفيديو مظاهرة لعزل صواريخ سام من فئران بالغة. ويتجلى طريقة أيضا للحفاظ على الكبار الماوس صواريخ سام في المختبر وexpressiعلى البروتينات الخارجية عن طريق عدوى الفيروسة الغدانية. معزولة تماما وصواريخ سام مثقف أعدت عن طريق هذه الأساليب هي مناسبة لمجموعة متنوعة من الدراسات الكهربية والتصوير.
Introduction
myocytes جهاز تنظيم ضربات القلب في العقدة الجيبية الأذينية للقلب (myocytes الجيبية الأذينية، "صواريخ سام") تولد عفوية، إمكانات العمل إيقاعي (الجزائرية) التي تنتشر من خلال عضلة القلب للشروع في كل نبضة قلب. وكانت التجارب باستخدام صواريخ سام معزولة تماما من العديد من الأنواع ضروري لتوضيح الآليات التي تساهم في توليد النشاط تنظيم ضربات القلب. صواريخ سام هي العضلية درجة عالية من التخصص التي تختلف كثيرا عن نظرائهم في الأذين والبطين عضلة القلب من حيث التشكل، وظيفة، والتعبير البروتين. السمة المميزة لنقاط وصول عفوية في صواريخ سام هو الاستقطاب عفوية أثناء انبساط الذي يدفع غشاء المحتملة لعتبة لتحريك AP المقبل 1،2. هذا "إمكانية تنظيم ضربات القلب" تعتمد على النشاط المنسق لكثير من التيارات المختلفة غشاء بما في ذلك "مضحك الحالية" (و أنا)، تي و L-نوع التيارات الكالسيوم، والصوديوم والكالسيوم المبادلات داءوالأنف والحنجرة (أنا NCX)، الذي يحركه إطلاق الكالسيوم 2+ من شبكية الهيولى العضلية 3،4.
في حين الماوس معزولة تماما صواريخ سام تشكل إعداد التجريبية أساسيا لدراسة pacemaking، وعزل من صواريخ سام من الفئران يمكن أن تكون وسيلة صعبة اعتماد لتشريح غير واضحة وصغر حجم SAN الماوس يتطلب تسليخ مجهري دقيق والأنزيمية جنبا إلى جنب والميكانيكية تفكك الخلايا يتطلب تحسين دقيق.
ونحن نقدم هنا مظاهرة الفيديو مفصلة من البروتوكول الذي تم استخدامه بنجاح لعزل صواريخ سام من فئران بالغة للتسجيلات المشبك التصحيح 8/5. على حد علمنا، ليس هناك مثل هذه التظاهرة البصرية المتاحة من أي مصدر آخر. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الطريقة الجديدة التي عزلت صواريخ سام من فئران بالغة لا يمكن الحفاظ عليه في المختبر لعدة أيام، مما يسمح إدخال البروتينات، المشفرة وراثياجزيئات مراسل أو رني عبر عدوى الفيروسة الغدانية 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الورقة بروتوكولات وإجراءات تفصيلية للعزلة وثقافة متباينة تماما myocytes العقدة الجيبية الأذينية من فئران بالغة. بروتوكول العزلة تنتج موثوق صواريخ سام الماوس نشطة بشكل عفوي مناسبة لأي تحليل الكهربية فوري أو ثقافة اللاحقة. وقد تم الإبلاغ عن بروتوكولات مماثلة من…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
Referências
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
- Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
- Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
- Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
- Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
- St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
- St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
- Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
- Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
- Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
- Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-gamma. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).
- Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).
- Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
- Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).
