成体マウスから洞房結節筋細胞の単離、培養、および機能解析のための方法
Summary
方法は、パッチクランプ電気生理学やイメージング研究のための成体マウスから洞房結節筋細胞（のSAM）の単離のために実証されています。単離された細胞を直接使用することができ、またはそのような遺伝的にコードされたレポーターとして、関心対象のタンパク質の発現を可能にするために、培養物中に維持することができます。
Abstract
洞房結節筋細胞（SAMは）自発的な活動電位（APを）を生成することにより、ビートそれぞれの心を開始し、心臓の自然のペースメーカーとして機能します。これらのペースメーカーAPは多数の膜電流と細胞内カルシウムサイクリングの協調活動を反映しています。しかし、SAMの中で自発的なペースメーカー活性を駆動する正確なメカニズムは、とらえどころのないまま。急性孤立したSAMは、心臓ペースメーカーの分子的基礎を分析するための実験のための不可欠な準備です。しかし、不明瞭な解剖学、複雑な顕微解剖、および気難しい酵素消化条件は急性孤立したSAMの普及を妨げてきました。また、方法は、タンパク質発現の研究のためにSAMの長期培養を可能にするために、最近まで利用できませんでした。ここでは、成体マウスからのSAMの単離のためのステップバイステップのプロトコルおよびビデオデモンストレーションを提供しています。この方法はまた、in vitroおよびde expressiのための成体マウスのSAMを維持するために実証されていますアデノウイルス感染を介した外因性タンパク質の上。これらの方法を介して調製急性単離し、培養したSAMは、電気生理学とイメージング研究の多様に適しています。
Introduction
ペースメーカー、心臓の洞房結節における筋細胞（洞房筋は、「SAMは」）、各ハートビートを開始するために、心筋を介して伝播自発的な、リズミカルな活動電位（APを）を生成します。多くの種から急性単離されたSAMを用いた実験は、ペースメーカー活性の発生に寄与メカニズムの解明のために不可欠でした。 SAMは、形態、機能、およびタンパク質発現の観点から、心房と心室の心筋での対応と実質的に異なる専門性の高い心筋細胞です。 SAMの中の自発的なAPの顕著な特徴は次のAP 1,2をトリガーするしきい値に膜電位を駆動する拡張期に自発的な脱分極です。この「ペースメーカー電位」は、「おかしな電流」（I f）は 、T-およびL型カルシウム電流、およびナトリウム-カルシウム交換体CURRを含む多くの異なった膜電流の協調活性に依存します筋小胞体3,4からのCa 2+放出によって駆動されるENT（I NCX）、。
急性単離したマウスのSAMはペースメーキングの研究に不可欠な実験の準備ですが、マウスSANの不明瞭な解剖学と小さいサイズが微妙な顕微解剖と組み合わせた酵素的および機械を必要とするため、マウスからのSAMの単離は、採用する挑戦的な方法することができます細胞の解離は慎重な最適化が必要。
ここでは正常にパッチクランプ記録5-8のための成体マウスからのSAMを単離するために使用されているプロトコルの詳細なデモビデオを提供しています。我々の知る限りでは、他のソースから入手できるそのような視覚的なデモンストレーションではありません。また、新たな方法は、成体マウスからのSAMの単離された実証される遺伝的にエンコードされ、それによってタンパク質の導入を可能にする、数日間インビトロで維持することができアデノウイルス感染9を介してレポーター分子またはRNAi。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、成体マウスから完全に分化洞房結節筋細胞の単離および培養のための詳細なプロトコルを提示します。分離プロトコルは確実に即時の電気生理学的解析やその後の培養のいずれかに適した自然発生的にアクティブなマウスのSAMを生成します。同様のプロトコル（例えば、11,12,10,13-17参考文献を参照）、他の多くのグループによって報告されています。しかし、in vitroで…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
Referências
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