Verfahren zur Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung von Sinoatrialknoten Myozyten aus erwachsenen Mäusen
Summary
Es sind Verfahren zur Isolierung von Sinusknoten Myozyten (SAMs) von erwachsenen Mäusen für Patch-Clamp-Elektrophysiologie oder Bildgebungsstudien demonstriert. Isolierte Zellen können direkt oder aufrechterhalten werden kann in Kultur zu ermöglichen, die Expression von Proteinen von Interesse, beispielsweise genetisch codierten Reporter verwendet.
Abstract
Sinoatrialknoten Myozyten (SAMs) fungieren als natürliche Schrittmacher des Herzens, jedes Herz durch die Erzeugung spontanen Aktionspotentiale (APs) schlagen zu initiieren. Diese Schrittmacher APs reflektieren die koordinierte Aktivität zahlreicher Membranströme und intrazellulären Calcium Radfahren. Allerdings sind die genauen Mechanismen, die eine spontane Schrittmacheraktivität in SAMs fahren bleiben schwer zu fassen. Akut isoliert SAMs sind eine wesentliche Vorbereitung für Experimente, die molekulare Basis von Herzschrittmacher zu sezieren. Allerdings ist die undeutliche Anatomie, komplexe Mikrodissektion und pingelig enzymatische Verdauung Bedingungen haben eine weit verbreitete Verwendung von akut isolierten SAMs verhindert. Außerdem wurden Verfahren erst kürzlich längerfristige Kultur von SAMs für die Proteinexpression Studien zu ermöglichen. Hier bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll und Video-Demonstration für die Isolierung von SAMs von erwachsenen Mäusen. Ein Verfahren ist auch für die Aufrechterhaltung der erwachsenen Maus SAMs in vitro und für expressi demonstriertauf exogener Proteine über Adenovirus-Infektion. Akut isoliert und mittels dieser Verfahren hergestellt SAMs sind für eine Vielzahl von elektrophysiologischen und Bildgebungsuntersuchungen geeignet.
Introduction
Schrittmachers Myozyten im Sinusknoten des Herzens (sinoatrial myocytes "SAMs") erzeugen spontane rhythmische Aktionspotentiale (APs), die durch das Myokard ausbreiten jedem Herzschlag zu initiieren. Experimente mit akut isoliert SAMs aus vielen Arten zur Aufklärung von Mechanismen wesentlich gewesen, die auf die Erzeugung von Schrittmacheraktivität beitragen. SAMs sind hoch spezialisierte Kardiomyozyten, die im Wesentlichen von ihren Kollegen in der atriale und ventrikuläre Myokard in Bezug auf die Morphologie, Funktion und Proteinexpression unterscheiden. Das Markenzeichen der spontanen APs in SAMs ist eine spontane Depolarisation während der Diastole, die das Membranpotential zu Schwelle treibt die nächste AP 1,2 auszulösen. Dieses "Schrittmacher Potential" hängt von der koordinierten Aktivität vieler verschiedener Membranströme , einschließlich der "lustige Strom" (I f), T- und L-Typ – Calciumströme und der Natrium-Kalzium – Austauscher current (I NCX), die 3,4 von Ca 2+ Freisetzung aus dem Retikulum angetrieben wird.
Während akut isolierten Maus SAMs eine wesentliche experimentelle Vorbereitung für die Untersuchung von Schrittmacher- sind, kann die Isolierung von SAMs von Mäusen ein herausforderndes Methode zu übernehmen, weil die undeutliche Anatomie und die geringe Größe des Maus-SAN eine nuancierte Mikrodissektion und das kombinierte enzymatische und mechanische erfordert Dissoziation der Zellen erfordert eine sorgfältige Optimierung.
Wir bieten hier eine detaillierte Video – Demonstration eines Protokolls, das für Patch – Clamp – Aufnahmen erfolgreich zur Isolierung 5-8 von erwachsenen Mäusen SAMs wurde. Unseres Wissens gibt es keine solche visuelle Demonstration zur Verfügung aus einer anderen Quelle. Zusätzlich wird ein neues Verfahren gezeigt , in denen getrennt SAMs von erwachsenen Mäusen können in vitro für einige Tage aufrechterhalten werden, wodurch die Einführung von Proteinen, genetisch kodierteReportermoleküle oder RNAi über Adenovirus – Infektion 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Beitrag stellt detaillierte Protokolle für die Isolierung und Kultur von vollständig differenzierten Sinoatrialknoten Myozyten aus erwachsenen Mäusen. Die Isolierung Protokoll erzeugt zuverlässig spontan aktive Maus SAMs geeignet für entweder sofort elektro Analyse oder Folgekultur. Ähnliche Protokolle wurden von vielen anderen Gruppen (siehe beispielsweise die Referenzen 11,12,10,13-17) berichtet. Jedoch unser Protokoll für die in vitro erwachsenen Maus SAMs Aufrechterhaltung bewahrt d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
Referências
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