Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri
Summary
Yöntemler yama kelepçe elektrofizyoloji veya görüntüleme çalışmaları için yetişkin farelerin sinoatriyal düğüm miyosit (SAMs) izolasyonu için gösterilmiştir. İzole edilmiş hücreler, doğrudan kullanılabilir ya da bu tür genetik olarak kodlanmış muhabir olarak ilgi proteinlerin ekspresyonuna izin vermek için kültür içinde muhafaza edilebilir.
Abstract
spontan aksiyon potansiyelleri (AP) oluşturarak yendi her kalbin başlatan kalbin doğal kalp pili olarak Sinoatriyal düğüm miyositler (SAMs) hareket. Bu kalp pili APs çok sayıda membran akımları ve hücre içi kalsiyum bisiklet koordineli etkinliğini yansıtır. Ancak SAMs spontan pacemaker aktivitesi sürücü kesin mekanizmalar halen mevcuttur. Akut izole SAMs deneyler kalp kalp vurusu moleküler temelini incelemek için önemli bir hazırlık vardır. Ancak, belirsiz anatomi, karmaşık mikrodisseksiyon ve titiz enzimatik sindirim koşulları akut izole SAMs yaygın kullanımını engellemiştir. Buna ek olarak, yöntemler, protein ekspresyon çalışmaları için SAM uzun dönemli kültür izin vermek için, yakın zamana kadar mevcut değildi. Burada erişkin farelerden SAM izolasyonu için adım adım protokolü ve video gösterimi sağlar. Bir yöntem olup, aynı zamanda in vitro ve de expressi yetişkin fare SAMs muhafaza etmek için gösterilmiştirAdenoviral enfeksiyon yoluyla ekzojen proteinlerin ilgili. Akut izole edilmiş ve bu yöntemlerle elde kültürlenmiş SAMs elektrofizyolojik ve görüntüleme çalışmaları çeşitli için uygundur.
Introduction
Kalp pili, kalbin sinoatriyal düğüm miyositler (sinoatriyal miyositler, "SAMs") her kalp atışı başlatmak için miyokardın yayılması spontan ritmik aksiyon potansiyelleri (AP) oluşturur. Birçok türlerden akut izole SAMs kullanarak deneyler pacemaker aktivitesi oluşturulmasına katkıda mekanizmaların aydınlatılması için gerekli olmuştur. SAMs morfolojisi, fonksiyon ve protein ifade bakımından atriyal ve ventriküler miyokardın kendi muadilleri önemli ölçüde farklılık çok özel kardiyomiyositlerde vardır. SAMs spontan AP damgasını sonraki AP 1,2 tetiklemek için eşik membran potansiyeli sürücüler diyastol sırasında bir spontan depolarizasyon olduğunu. Bu, "kalp pili potansiyeli" farklı "komik Geçerli" (I f) de dahil olmak üzere membran akımları, T ve L-tipi kalsiyum akımları ve sodyum-kalsiyum değiştirici Curr koordineli aktivitesine bağlısarkoplazmik retikulum 3,4 Ca 2+ salınımı tarafından yönlendirilen ent (I NCX).
akut izole fare SAMs kalp vurusu çalışmaları için önemli bir deneysel hazırlık iken fare SAN belirsiz anatomi ve küçük boyutlu bir nüanslı mikrodiseksiyon ve kombine enzimatik ve mekanik gerektirdiğinden, farelerden alınan SAMs izolasyonu benimsemeye zor bir yöntem olabilir hücre ayrışma dikkat optimizasyon gerektirir.
Biz burada başarılı yama kelepçe kayıtları 5-8 yetişkin farelerin SAMs izole etmek için kullanılan bir protokol ayrıntılı bir video gösteri sunar. Bildiğimiz kadarıyla, başka bir kaynaktan temin böyle bir görsel gösteri var. Buna ek olarak, yeni bir yöntem olup, burada gösterilmiştir erişkin farelerden böylece genetik olarak kodlanmış proteinlerin giriş izin, birkaç gün, in vitro olarak korunabilir SAMs izoleAdenoviral enfeksiyon 9 vasıtasıyla haberci moleküllerin veya RNAi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu kağıt yetişkin farelerin tamamen farklılaşmış sinoatriyal düğüm miyosit izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı protokoller sunar. yalıtım protokolü güvenilir anında elektrofizyolojik analizi ya da sonraki kültür ya da uygun kendiliğinden aktif fare SAMs üretir. Benzer protokolleri (örneğin, 11,12,10,13-17 referanslara bakın) birçok diğer gruplar tarafından rapor edilmiştir. Bununla birlikte, in vitro olarak yetişkin fare SAMs muhafaza edilmesi için protokol karakte…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
Referências
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
- Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
- Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
- Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
- Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
- St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
- St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
- Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
- Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
- Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
- Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-gamma. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).
- Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).
- Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
- Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).
