Méthodes pour l'isolement, la culture et la caractérisation fonctionnelle des sinoatrial Node myocytes de souris adultes
Summary
Les méthodes sont mises en évidence pour l'isolement des myocytes nœud sino-auriculaire (SAMS) provenant de souris adulte pour les études électrophysiologiques de patch-clamp ou d'imagerie. Les cellules isolées peuvent être utilisés directement ou peuvent être maintenues en culture pour permettre l'expression de protéines d'intérêt, comme rapporteurs codés génétiquement.
Abstract
myocytes nœud sinusal (GSB) agissent comme les stimulateurs cardiaques naturelles du cœur, initiant chaque battement de coeur en générant des potentiels d'action spontanés (AP). Ces points d'accès du stimulateur reflètent l'activité coordonnée de nombreux courants membranaires et intracellulaires vélo de calcium. Cependant, les mécanismes précis qui animent l'activité pacemaker spontanée dans SAMs demeurent insaisissables. Pleinement SAMs isolées sont une préparation essentielle pour les expériences de disséquer la base moléculaire de pacemaker cardiaque. Cependant, l'anatomie indistincte, microdissection complexe, et les conditions de digestion enzymatique tatillonnes ont empêché l'utilisation généralisée de aiguë isolée GSB. En outre, les méthodes ne sont pas disponibles jusqu'à récemment pour permettre la culture à long terme de SAMs pour les études d'expression de protéines. Ici, nous fournissons un protocole et vidéo de démonstration étape par étape pour l'isolement des SAMs de souris adultes. Un procédé est également démontrée pour le maintien de la souris adulte GSB in vitro et pour expressisur des protéines exogènes par une infection adénovirale. Pleinement isolées et cultivées SAMs préparées par ces procédés sont appropriés pour une variété d'études électrophysiologiques et d'imagerie.
Introduction
myocytes pacemakers dans le nœud sinusal du cœur (myocytes sinoatrial, "GSB") génèrent, potentiels spontanés rythmiques d'action (PA) qui se propagent à travers le myocarde pour initier chaque battement de cœur. Des expériences utilisant SAMs aiguë isolées de nombreuses espèces ont été essentiels pour l'élucidation des mécanismes qui contribuent à la génération de l'activité pacemaker. SAMs sont cardiomyocytes hautement spécialisées qui diffèrent sensiblement de leurs homologues de l'auriculaire et ventriculaire myocardique en termes de morphologie, la fonction et l'expression des protéines. La marque de points d' accès spontanés dans GSB est une dépolarisation spontanée pendant la diastole qui conduit le potentiel de membrane au seuil pour déclencher le prochain point d' accès de 1,2. Ce «potentiel de stimulateur" dépend de l'activité coordonnée de nombreux courants différents de la membrane , y compris la «drôle de courant" (I f), T et de type L courants de calcium et le sodium-calcium échangeur current (I NCX), qui est entraîné par Ca la libération du réticulum sarcoplasmique 3,4.
Alors que la souris aiguë isolée SAMs sont une préparation expérimentale essentielle pour l'étude de pacemaker, l'isolement des SAMs de souris peut être une méthode difficile à adopter, car l'anatomie indistincte et la petite taille du SAN souris nécessite une microdissection nuancée et enzymatique combiné et mécanique dissociation des cellules nécessite une optimisation minutieuse.
Nous fournissons ici une vidéo de démonstration détaillée d'un protocole qui a été utilisé avec succès pour isoler SAMs de souris adultes pour les enregistrements de patch clamp 5-8. À notre connaissance, il n'y a pas une telle démonstration visuelle disponible à partir de toute autre source. En outre, une nouvelle méthode est mise en évidence dans laquelle isolé GSB de souris adultes peuvent être maintenues in vitro pendant plusieurs jours, ce qui permet l'introduction de protéines codées génétiquementmolécules reporters ou ARNi via une infection adénovirale 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présente des protocoles détaillés pour l'isolement et la culture de complètement différenciées myocytes nœud sinusal de souris adultes. Le protocole d'isolement produit fiable SAMs de souris spontanément actifs appropriés soit pour l'analyse électrophysiologique immédiate ou la culture subséquente. Des protocoles similaires ont été rapportés par de nombreux autres groupes (par exemple, voir les références 11,12,10,13-17). Cependant, notre protocole pour le maintien de …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
Referências
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
- Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
- Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
- Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
- Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
- St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
- St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
- Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
- Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
- Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
- Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-gamma. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).
- Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).
- Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
- Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).
