Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måling Influenza neuraminidase Inhibering Antistoftitere af Enzyme-linked lectin Assay

Published: September 6, 2016 doi: 10.3791/54573
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Viral Products, CBER, Food and Drug Administration

Abstract

Antistoffer mod neuraminidase (NA), den anden mest udbredte overflade protein på influenzavirus, bidrager mod beskyttelse mod influenza. Traditionelle metoder til måling af NA inhibering (NI) antistoftitere er ikke praktiske til rutinemæssig serologi. Denne protokol beskriver enzymbundet lectin assay (ELLA), et praktisk alternativ metode til at måle NI titere, der udføres i 96-brønds plader coatet med et stort glycoprotein substrat, fetuin. NA spalter terminal sialinsyrer fra fetuin, udsætter den næstsidste sukker, galactose. Jordnøddeagglutinin (PNA) er et lectin med specificitet for galactose og derfor omfanget af desialylering kan kvantificeres ved anvendelse af en PNA-peberrodsperoxidasekonjugat, efterfulgt af tilsætning af et chromogent peroxidasesubstrat. Den optiske densitet, som måles, er proportional med NA-aktivitet. Til måling NI antistoftitere, er serielle fortyndinger af sera inkuberet ved 37 ° CO / N på fetuin-overtrukne plader med et fast beløb of NA. Den reciprokke værdi af den højeste serumfortynding, som resulterer i ≥50% inhibering af NA-aktivitet er udpeget som NI antistoftiter. Den ELLA er en praktisk format for rutinemæssig evaluering af humane antistof-reaktioner efter influenza infektion eller vaccination.

Introduction

Neuraminidase (NA) er et glycoprotein udtrykt på overfladen af ​​influenza virioner. Dens enzymaktivitet er afgørende for frigivelse af nydannede viruspartikler fra inficerede celler 1,2. Antistoffer, der inhiberer NA aktivitet reducere virustitere og sygdomssymptomer i dyremodeller 3 og korrelerer med resistens mod sygdom hos mennesker 4. En stigning i NA hæmning (NI) titre efter vaccination kan derfor tjene en indikator for vaccinens effekt, men mange fortid influenza immunogenicitetsundersøgelser omfattede ikke dette effektparameter fordi den traditionelle assay til måling af NI antistoftitre er upraktisk til rutinemæssig serologi.

Den traditionelle metode til måling NI titere er baseret på kvantificering af mængden af sialinsyre, der spaltes fra glycokonjugater af NA 1. Denne metode, der ofte omtales som den thiobarbitursyre (TBA) -metoden, benytter farlige kemikalier til at konvertere sialinsyre acid til en chromophor, der kan kvantificeres ved spektrometri. Assayet er ikke egnet til at teste et stort antal prøver, fordi der anvendes individuelle rør, hvilket gør assayet besværlig. Miniaturisering af assayet til en 96 brønds plader giver en mere praktisk format 5, men dette assay kræver stadig anvendelse af giftige kemikalier og er derfor ikke ideel.

En alternativ assay til måling NI antistoftitere blev udviklet af Lambre et al. 6. Dette assay kvantificerer enzymaktivitet ved at måle mængden af ​​næstsidste sukker af glycoproteiner, galactose, som bliver blotlagt, når sialinsyre er udgivet af NA. Da peanut-agglutinin (PNA) binder specifikt til galactose, kan en PNA-peberrodsperoxidase (HRPO) konjugat anvendes til at opnå en kolorimetrisk udlæsning. Den optiske densitet, som måles, er således proportional med NA-aktivitet i prøven. NI titre måles ved at bestemme den højeste fortyndingaf serum, som inhiberer mindst 50% af NA-aktivitet. Dette enzym-koblet lectin assay (ELLA) udføres i plader med 96 brønde overtrukket med fetuin, et stærkt glycosyleret serumprotein, som substratet for NA.

En vigtig overvejelse for assays, der måler NI titere, er kilden til NA. Dette skyldes sera fra vaccinerede eller smittede individer indeholder antistoffer mod hæmagglutinin (HA) samt antistoffer mod NA. Antistoffer, som binder til HA kan forstyrre NA-aktivitet, og derfor, for at undgå ikke-specifik inhibering af HA-specifikke antistoffer, oprenset NA eller helt virus indeholdende et antigent uoverensstemmende HA bør anvendes i assayet. Disse vira kan genereres ved klassiske resortering eller ved revers genetik; målet er at redde en virus, der indeholder HA af en undertype, der ikke er relateret til mål-stamme, og NA af virus, som studeres. Den beskrives i denne artikel assay beskæftiger influenza A virus, som genereres af reverse genetik til at indeholde HA af subtype H6 og den målrettede NA fra influenza A virus, subtype H1N1 og H3N2 fem.

Resultater genereret af ELLA og miniaturiserede TBA analyser viser disse metoder er sammenlignelige, med lignende undertype specificitet og sensitivitet 7. ELLA ikke kræver brug af farlige kemikalier, og derfor er den foretrukne metode til at måle NI titre. Det er let at udføre, med kun et par trin (figur 1): Prøverne fortyndes og overføres til en fetuin-coatede plade, hvortil virus (kilden til NA) tilsættes. Pladen inkuberes O / N og vasket før tilsætning PNA-HRPO. Efter en 2 timers inkubation, pladen vaskes, og der tilsættes peroxidase substrat; farven Reaktionen standses og endelig den optiske densitet måles, og det reciprokke af prøveopløsning, som resulterede i mindst 50% inhibering af NA-aktivitet rapporteres som 50% endepunktstiter. En intra-laboratorium undersøgelse for at vurdere reproducibility af ELLA, viste, at plade-til-plade variabilitet er minimal og operatør-til-operatør repeterbarhed resulterede i ikke mere end 2-fold forskelle i titer 7. En efterfølgende inter-laboratorieundersøgelse af ELLA variabilitet viste, at analysen har god reproducerbarhed, når de udføres i forskellige laboratorier og at optagelsen af et standard kan yderligere reducere variation i resultater 8. Den ELLA er egnet til måling NI antistoftitere i serum paneler fra prækliniske og kliniske influenzavaccine undersøgelser 7 og kan også anvendes til at evaluere antigene forskelle mellem NA'erne af influenzavirus 9.

Protocol

Alle levende reassortant virus med aviær komponenter skal håndteres ved hjælp biosikkerhed niveau 2 (BSL2) -forbedrede praksis i et laboratorium, der er godkendt til brug af United States Department of Agriculture (USDA) og den institutionelle biosikkerhed udvalget.

1. Fremstilling af reagenser og Udgangsmateriale

Bemærk: Se den Materials Tabel for at få kilden til alle reagenser.

  1. Fetuin-overtrukne plader
    1. Forbered coating buffer ved at blande 10 ml 10x coating buffer med 90 ml deioniseret H2O
    2. Der fremstilles en stamopløsning af fetuin ved 25 mg / ml i 1 x coating buffer og opbevares i 500 pi prøver ved -20 ° C.
    3. Forbered en arbejdsgruppe løsning af fetuin (25 ug / ml) umiddelbart før belægning plader ved at fortynde stamopløsningen 1000 gange i 1x coating buffer.
    4. Brug en multikanal pipette til at dispensere 100 pi af arbejdsopløsningen af ​​fetuin i all brønde i en plade med 96 brønde, der har høj proteinbindende kapacitet.
    5. Dæk hver plade med en pladeforsegler derefter stable pladerne i grupper af 10 og pak dem ind i folie.
    6. Placer pladerne i køleskab (2-8 ° C) i mindst 18 timer før udførelse af et assay.
      Bemærk: Plader kan overtrækkes i forvejen og opbevares med coatingopløsningen ved 2-8 ° C i op til 2 måneder.
  2. fortyndingsmidler
    1. Til fremstilling af fortyndingsmiddel for at gøre virus- og prøvefortyndinger (2- (N -morpholino) ethansulfonsyre (MES), pH 6,5, 20 mM CaCl2, 1% bovint serumalbumin (BSA) og 0,5% Tween 20), blandes 94,2 ml 1X MES, pH 6,5 med 2 ml CaCI2 (10 mg / ml), 3,3 ml 30% BSA og 0,5 ml Tween 20.
    2. Til fremstilling af fortyndingsmiddel til PNA-HRPO (MES, pH 6,5 med 20 mM CaCl2 og 1% BSA), blandes 94,7 ml 1x MES, pH 6,5 med 2 ml CaCI2 (10 mg / ml), og 3,3 ml 30% BSA .
  3. Neuraminidase (NA)
    Bemærk: H6Nx virus reassortants (disse har HA i H6 undertype og NA af interesse), genereres følgende offentliggjorte metoder 5,10. Anmod hætteglas med inaktiveret reassortant virus fra en samarbejdspartner, hvis de ikke er tilgængelige i huset. Ved brug af inaktiverede virus, bekræfter, at præparatet er egnet til brug i ELLA gennem demonstrationen, at inaktivering processen ikke havde en betydelig indvirkning på NA-aktivitet.
    1. Kultur et lager af H6Nx virus i befrugtede hønseæg 11 og lagre 0,5 ml alikvoter af ublandet allantoisvæske ved -80 ° C.
    2. Brug en ny portion af virus for hvert assay. Må ikke fryses og optøs portioner.
  4. Serum prøver og kontroller
    1. Heat-inaktivere alle sera (prøveemner fx før og efter vaccination sera, samt kontrol, fx prøve med kendt NI titer) i et vandbad ved 56 ° C i 45-60 min. Opbevar sera ved -20 til -70 ° C før eller efter varmebehandlingen. Hvis Samples skal testes flere gange, foretage flere portioner før frysning, så prøven ikke er gentagne gange frosset og optøet.
    2. Brug ELLA at måle NI titre af humane sera, der er tilgængelige i rimelig mængde (> 5 ml) for at identificere mindst én med lav titer og en anden med en høj titer. Opbevar 100 pi alikvoter som ≤-20 ° C, således at den samme prøve kan anvendes som en kontrol i mange assays for at spore assay performance.
  5. Jordnøddeagglutinin (PNA) -Horseradish peroxidase (HRPO)
    1. Forbered PNA-HRPO fortyndingsmiddel (MES, pH 6,5 med CaCl2 og 1% BSA).
    2. Forbered en PNA-HRPO stamopløsning ved at opløse 1 mg PNA-HRPO i 1 ml solvens. Opbevar 20-200 pi alikvoter ved -20 ° C.
    3. Før brug af en ny PNA-HRPO parti, test 1: 500, 1: 750, 1: 1,000 og 1: 2000 fortyndinger af dette reagens til at identificere den mængde, som resulterer i maksimal OD med den positive kontrol (virus kun) og en baggrund ( intet virus) that er <10% af det positive signal.
      1. Foretag firdobbelte virusfortyndingerne som beskrevet i afsnit 2.1.
      2. Overfør fortyndinger til en fetuin belagt plade, som beskrevet i afsnit 2.2 og inkuberes pladen ved 37 ° C.
      3. Vask pladen 16-18 timer senere og tilsæt 1: 500, 1: 750, 1: 1,000 og 1: 2.000 fortyndinger af PNA-HRPO (100 pi / brønd) at duplikere rækker af pladen.
      4. Gennemfør analysen som beskrevet i trin 2.3.4 til 2.3.9.
      5. Gennemse dataene til at vælge den fortynding, der resulterede i en maksimal signal, der er> 10 gange baggrunden.
    4. Umiddelbart før brug, forberede den optimale fortynding af PNA-HRPO identificeret i 1.5.3.
  6. Forbered et stort volumen af ​​vaskebuffer (0,01 M phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,4, 0,05% Tween 20 (PBS-T)). Opbevar ved stuetemperatur.
  7. Forbered peroxidase substrat (o-phenylendiamin-dihydrochlorid (OPD)): Bemærk: Alternative peroxidasesubstrater såsom 3,3 ', Kan der anvendes 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB)
    1. Forbered phosphat-citratbuffer ved opløsning 1 kapsel i 100 ml dH2O på dagen for assayet.
    2. Opløs 1 OPD tablet (10 mg) i 20 ml phosphat-citratbuffer umiddelbart før brug.
  8. Forbered stop-løsning (1 NH 2 SO 4): tilføj 27,2 ml lager 98% H 2 SO 4-973 ml dH 2 O. Mix og derefter opbevares ved stuetemperatur.

2. Bestemmelse af mængden af ​​NA til brug i ELLA

  1. Forbered virusfortyndingerne i en plade med 96 brønde
    1. Dispenser 120 pi prøve fortynder (afsnit 1.2) i kolonner 1-11 af fortyndingen pladen.
    2. Til kolonne 1, tilføje en ekstra 96 ​​pi prøve fortynder.
    3. Optø og derefter vortex hætteglasset med virus, før du tilføjer 24 pi til huller til dobbeltbestemmelse i kolonne 1. Det giver en 1:10 fortynding af virus.
    4. Gør serielle 2-foldige fortyndinger af virus i prøven fortyndingsmiddel, ved at overføre120 pi fra én brønd til de næste bruger rene pipettespidser for hver fortynding.
  2. Overfør virusfortyndingerne til en fetuin-overtrukne plade
    1. Vask fetuin-coatede plade 3 gange med PBS-T (afsnit 1.6) og derefter duppes hver plade mod absorberende papirserviet for at fjerne overskydende vaskebuffer.
    2. Der tilsættes 50 pi prøve fortyndingsmiddel (afsnit 1.2.1) til hver brønd i kolonne 1 til 11 i fetuin-overtrukne plade.
    3. Tilsæt 100 pi prøve fortyndingsmiddel til kolonne 12 (disse brønde er den negative kontrol).
    4. Transfer 50 pi fortyndet virus fra kolonnerne 1-11 af fortyndingen plade til de tilsvarende brønde i fetuin-overtrukne plade.
    5. Dæk pladen med en pladeforsegler og derefter placere den i en fugtig inkubator ved 37 ° C.
    6. Notér det tidspunkt, hvor vil blive udført resterende trin (16-18 timer senere).
  3. Gennemfør NA Bestemmelse
    1. Når inkubationen er fuldstændig (16-18 timer), overførplade til bænken, og fjern pladeforsegler.
    2. Vask pladen 6 gange med PBS-T (afsnit 1.7) og derefter vendes og klap på sugende papirservietter til at sikre al væske er blevet fjernet fra brøndene.
    3. Der tilsættes 100 pl / brønd PNA-HRPO-opløsning (ved fortynding bestemt i 1.5.3) til alle brønde og inkuberes pladen i 2 timer ved stuetemperatur.
    4. Mindre end 15 minutter før inkubationen er at ende, forberede OPD løsning som beskrevet i afsnit 1.7.
    5. Vask testpladerne 3 gange for at fjerne PNA-HRPO og tørres før tilsætning af 100 pi af OPD substrat til hver brønd.
    6. Inkubér pladen i nøjagtigt 10 minutter ved stuetemperatur.
    7. Reaktionen standses ved tilsætning af 100 pl / brønd 1 N svovlsyre.
    8. Brug en plade læser til at måle den optiske densitet (OD) ved 490 nm for 0,1 sek.
    9. Gem og eksportere alle datafiler.
  4. Vælg Virus Fortynding der vil blive anvendt til Serologi
    1. Tegn en graf, der plotter OD 490 nm (dvs. lineære område af kurven).
    2. Vælg den virusfortynding, som giver ca. 90% af det maksimale signal og er inden for det lineære område. Bekræfter, at OD ved den valgte fortynding er mindst 10 gange større end baggrundssignalet. Bruge den valgte virusfortynding for alle assays, der anvender denne særlige virus lager.
      Bemærk: Du kan også måle NA aktiviteten af ​​virus og bruge ~ 15-20 g enhed NA aktivitet / ml i ELLA.

3. Enzym-linked Lectin Assay

Bemærk: Figur 2 shows opsætningen af ​​fortyndingen og assay plader.

  1. Foretag prøvefortyndinger
    1. Placer varme-inaktiverede prøver på is.
      Bemærk: 8 sera kan fortyndes i hver plade.
    2. For en oprettet bruger fortyndinger starter ved 1:10 hen over pladen, tilsæt 120 pi prøve fortynder til alle brønde i kolonne 3-11.
    3. Til kolonne 2, tilsættes 216 ul prøve fortynder og 24 pi af hver prøve. Prøven blandes i brønden ved pipettering op og ned 3 gange og derefter overføre 120 pi til den næste kolonne.
    4. Efter ændring pipettespidser, blande indholdet i brønden ved pipettering op og ned og derefter overføre 120 pi til den næste kolonne.
    5. Gentag trin 3.1.4, indtil prøven er blevet overført til kolonne 11, og de resterende 120 pi kasseret.
  2. Tilføj Prøver og Virus til fetuin-coatede plade
    1. Optø et hætteglas med virus, vortex og resuspender virus i fortynderen (afsnit 1.2) ved fortynding, der blev valgt i trin 2.4.2. Fremstilles mindst 5 ml virus for hver assayplade. Hold den fortyndede virus på is indtil pladerne vaskes og serumprøver er blevet tilsat til pladen.
    2. Beslut om antallet af fetuin-plader, der er nødvendige for analysen (gælder generelt 4 sera per plade). Vask fetuin-coatede plade 3 gange med PBS-T og derefter vendes hver plade og duppes over på absorberende køkkenrulle for at fjerne overskydende vaskebuffer.
    3. Brug en multikanal pipette til at overføre 50 pi af hvert serum kontrol eller prøve fortynding fra fortyndingen pladen i dobbelte brønde i spalte 2-11.
    4. Der tilsættes 50 pi fortyndet virus til alle brønde undtagen den negative kontrol (kolonne 12).
    5. Tilsæt 50 ul prøve fortynder til brønde i kolonne 1 og tilsæt 100 ul prøve fortynder til kolonne 12.
    6. Dæk brøndene med en pladeforsegler og derefter blandes ved forsigtigt at banke sider af pladen eller anbringelse på en plade rysteapparat ved moderat hastighed i 10 sek.
    7. Pladen anbringes i en humidifIED inkubator ved 37 ° C i 16-18 timer.
  3. Tilføj PNA-HRPO og færdiggøre analysen som beskrevet i afsnit 2.3

4. Data Analysis

  1. Bestem gyldighed analyseresultaterne
    1. Kontroller, at baggrundsværdier (ingen virus) er mindre end 10% af den positive kontrol (virus og ingen serum).
    2. Kontroller, at titre af kontrolsera køre i forskellige analyser med de samme betingelser er indenfor 2-fold af medianen titer.
    3. Bekræft, at OD målinger af kontrolbrønde er konsistente (≤20% anderledes), og at OD målinger af duplikatprøvebrøndene er konsistente (≤10% anderledes).
    4. Bestem årsagen til ugyldige resultater og gentages analysen, hvis kriterierne i 4.1.1, 4.1.2 eller 4.1.3, ikke er opfyldt. Overvej de faktorer i tabel 1, når de forsøger at foretage fejlfinding.
  2. Tildel en 50% endepunktstiter
    1. For hver assayplade, subtract den gennemsnitlige baggrund (uden tilsat til brønde antigen) fra alle aflæsninger.
    2. Beregn procent inhibition ved hver serumfortynding ved hjælp af formlen: 100 x (OD virus kun kontrol - OD test prøve) / OD-virus kun kontrol.
    3. Identificere den højeste fortynding, som resulterede i mindst 50% inhibering af det maksimale signal.
    4. Rapporterer den reciprokke værdi af denne fortynding som den 50% endepunktstiter.
      Bemærk: Hvis 50% inhibering ikke var opnået ved enhver fortynding titeren er mindre end den første testede fortynding, f.eks <10, når 01:10 er det først afprøvede fortynding.
  3. Beregn 50% inhiberende koncentration (IC50)
    1. Brug fire parameter logistiske regressioner til at bestemme IC50 titer som følger: trække den gennemsnitlige baggrund fra alle aflæsninger og derefter overføre resultaterne til et program, der udfører regressionsanalyse.
    2. Brug ikke-lineær regression, med den maksimale sætfor virus kun styre og den minimale sat til nul, for at bestemme den fortynding, der svarer til nøjagtig 50% inhibering.
    3. Rapporterer den reciprokke værdi af denne fortynding som IC50 titer.

Representative Results

Assayet præsenteret i dette håndskrift er vist skematisk i figur 1. Figur 2 viser brønds plade layout 96, og indikerer, at serielle fortyndinger af serumprøver fremstillet i en fortynding plade før de overføres til den fetuin-overtrukne plade. En kritisk parameter for assayet er mængden af ​​neuraminidase, som anvendes i assayet; dette bestemmes ved titrering af reassortant virus. Eksempler på H6N1 og H6N2 virus titreringer er vist i figur 3. Ved 1:10, 1:20, og 1:40 fortyndinger af H6N1, den optiske densitet var ens, hvilket indikerer, at betingelserne var således, at en maksimal aflæsning blev opnået. Ved en 1:80 fortynding, udlæsningen var ca. 90% af den maksimale og derfor er denne fortynding af virus blev anvendt i efterfølgende assays. Eksempler på serum titreringer er vist i figur 4. Figuren viser en human serumprøve, der var titreret mod H6N1 og H6N2 virus. Hvert datapunkt viser den procentvise hæmning af NA-aktivitet, der blev opnået ved serielle fortyndinger af serum; den første serumfortynding i H6N1 assayet var 1:80; den første fortynding af serum i H6N2 assayet var 5. Da den højeste fortynding, der resulterer i ≥50% inhibering er NI antistoftiter titeren af ​​serum vist i dette eksempel er 640 imod NA fra NC / 99 (N1) og 160 imod NA af WI / 05 (N2).

figur 1
. Figur 1. En skematisk af ELLA protokol (A) Bestemmelse af fortynding af antigen (virus) til brug i analysen (trin 2 i protokollen): Virus fortyndinger tilsættes en fetuin belagt plade og NA-aktivitet målt ved kvantificere terminal galactoserester gennem binding af PNA-HRPO som beskrevet i trin 2.3 i protokollen; (B g>) Bestemmelse af serum NI antistoftitre (trin 3 i protokollen). Prøver fortyndes og overføres derefter til en fetuin-overtrukket plade, hvor der tilsættes virus. Pladen inkuberes O / N, før du tilføjer PNA-HRPO og færdiggøre de nødvendige skridt for at generere en farvereaktion. Endelig er farven standses reaktionen, og den optiske densitet måles. Den reciprokke af prøven fortynding, der resulterer i mindst 50% hæmning af NA-aktivitet er rapporteret som 50% endepunktstiter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Diagram at vise ELLA plade oprettet. Seriefortyndinger af serumprøver er lavet i en fortynding plade og derefter overført til en fetuin-overtrukket plade. 3fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Eksempler på H6N1 og H6N2 virus titreringer. Serielle fortyndinger af H6N1 BR / 07 (NA A / Brisbane / 59/2007 (H1N1) er vist i blå symboler) og H6N2 UR / 07 (NA i A / Uruguay / 716 / 2007 (H3N2) vist i røde symboler) blev inkuberet i 18 timer i fetuin-overtrukne plader og reaktivitet med PNA-HRPO bestemt som beskrevet. Gennemsnit OD 490 nm af 2 brønde er plottet mod den reciprokke værdi af den virusfortynding. Fortyndingen af ​​H6N1 udvalgt til anvendelse i ELLA var 1:80 og fortyndingen af ​​H6N2 valgt var 01:40, fordi disse fortyndinger resulterede i ca. 90% af den maksimale optiske densitet og var inden for det lineære område.3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Titrering af serum mod NA N1 (røde symboler) og N2 (blå symboler) undertyper. NA hæmning titre blev målt mod reassortant virus H6N1 NC / 99 (indeholder NA A / Ny Kaledonien / 20/1999 (H1N1) ) og H6N2 WI / 05 (indeholder NA A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). Procent enzyminhibering til serielle fortyndinger af serum er vist med den punkterede horisontale linie indikerer 50% inhibering. De NA hæmning titre mod de nationale kontorer i A / Ny Kaledonien / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) og A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) var 2 9.3 (640) og 2 7.3 ( 160), henholdsvis. klik her for at se et større version af dette tal.

Problem Mulig årsag (er) Løsning
Svagt signal eller intet plateau nåede i virustitrering i) lav NA enzymaktivitet
ii) virus lager ikke opbevaret under optimale forhold 		i) bekræfter, at fortyndingsmidlet har pH, der er optimal for NA-aktivitet; hvis pH er optimal, udarbejde en ny virus bestand eller koncentrat virus
ii) Regrow og alikvot lager; snap-freeze hætteglas på tøris før de opbevares ved -80 ° C
Svag eller ingen farve i positive celle kontrolbrønde i) Virus fortynding forkert tildelt
ii) Hætteglas-til-hætteglas variabilitet i frosne virus alikvoter
iii) PNA- HRPO denatureret eller fortyndet for meget
iv) OPD forkert fremstillet 		jeg); Gentag virustitrering
ii) titreres flere hætteglas fra samme parti for at sikre, at der ikke er nogen variation. Hvis betydelig variation, forberede friske portioner
iii) Brug optimal virus fortynding til retitrate PNA- HRPO
iv) Gentag med frisk fremstilling af OPD
Svag eller ingen hæmning af positiv kontrol-sera i) For meget virus, der anvendes i assayet
ii) Serum forværret 		i) Gentag virustitrering
ii) Opnå nye antisera Check opbevaringsforhold
Hæmning med negative kontrolsera i) Utilstrækkelig varmebehandling af serum
ii) For lidt virus, der anvendes i assayet 		i) Gentag varmeinaktivering af serum
ii) Gentag virustitrering
høj baggrund i) Eventuel forurening af plader
ii) PNA- HRPO koncentration for stor / for lav 		i) Gentag hjælp frisk overtrukne plader
ii) Titrer PNA-HRPO at identificere korrekte fortynding til brug
Virustitrering viser tilsyneladende inhibering af NA-aktivitet ved lave fortyndinger i) Allantoisvæske kan indeholde substrat for NA ii) Anvendelse virus, der er blevet pelleteret gennem en saccharosepude

Tabel 1. kerneårsagsanalyse af analyser, der ikke opfylder kriterierne ydeevne. Denne tabel giver mulige årsager og løsninger på problemer, der kan opstå, når du udfører ELLA.

Discussion

Den enzymbundet lectin-analysen er en praktisk metode til at måle NI antistoftitere i sera. Selv ELLA blev beskrevet af Lambre et al., I 1990, har den som et standard serologisk assay været nyere, med mange laboratorier, der udfører analysen at måle NI antistoftitre på kliniske prøver 12-16. Nogle modifikationer kan foretages protokoltrin uden en stor indflydelse til Ni-titre, som måles. For eksempel kan PBS bruges som fortynder, men det er meget nyttigt at sammenligne virus titreringskurver i den anbefalede buffer (MES, pH 6,5) og PBS, før der træffes afgørelse, som nogle NA undertyper markant har reduceret enzymaktivitet ved pH> 7,0. Når der ikke anvendes den optimale pH, kan den maksimale signal af virus reduceres, hvilket resulterer i anvendelsen af en stor mængde af antigen (dvs. virus) i assayet; under disse betingelser kan assayet har reduceret følsomhed.

Nogle nejobserveres n-specifik hæmning når ubehandlet sera testes i ELLA. Dette fjernes ved varmebehandling (56 ° C i 45 minutter), hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​termolabile p-inhibitorer. Andre ikke-specifikke inhibitorer (α og γ-klasse) af influenza HA er blevet beskrevet, især i forbindelse med H3N2-virus hæmagglutinering og infektivitet. Faktisk er ikke-specifik inhibering også observeret i ELLA når H3N2 virus anvendes som kilde til NA; denne inhibering fjernes ved behandling af serumprøverne med en lille mængde af sialidase 9.

Som for andre serologiske assays, bør negative og positive kontroller inkluderes i hvert assay for at tilvejebringe et middel til at vurdere assay performance. Når analysen ikke har opfyldt acceptkriterier, bør årsagen kan identificeres. Tabel 1 giver en liste over potentielle skridt i analysen, der kan rettes til fejlfinding af problemer.

Den ELLA protokol provided i denne rapport anvendes reassorterede vira, der indeholder HA oprindelse fra en aviær virus, som kilden til NA. Dette giver en begrænsning til at udføre analysen, fordi der kræves tilladelse til at arbejde med lavpatogen aviær virus. H6Nx reassortant virus kan deles mellem laboratorier, efter at de er blevet inaktiveret. Derfor analysen kan gennemføres gennem samarbejde, når laboratoriet genererer reassortant virus har vist, at inaktivering er komplet og forberedelsen har bevaret sin NA-aktivitet. Den begrænsning af brug af H6Nx reassorterede vira kan overvindes ved hjælp af ikke-infektiøse kilder til NA. For eksempel har nogle laboratorier anvendt oprenset rekombinant NA 17, mens andre har anvendt viruslignende partikler (VLP'er) 15. Men hverken rekombinant NA eller VLP er let tilgængelige, og derfor fortsætter vi med at bruge influenzavirus med en antigen-uoverensstemmende aviær HA.

den traditionellemetode til at måle NI antistoftitere er ikke praktisk af flere grunde; af de fleste bekymring er de skadelige kemikalier, der er nødvendige for at producere en farvereaktion. Desuden er store mængder prøve er nødvendig, og analysen er besværlig at udføre. I modsætning hertil ELLA er let at udføre og er i et format, der tillader titrering af et rimeligt antal prøver. Data fra studier, der undersøgte ELLA variabilitet viser, at assay udbytter reproducerbare resultater 7,8. Den ELLA har derfor gjort rutine måling af NI antistoftitre muligt, og det forventes, at det vil blive brugt oftere af laboratorier, der foretager serologiske undersøgelser.

Der er flere kritiske trin, der skal overvejes, når du udfører ELLA. For det første skal ikke-specifikke inhibitorer af NA-aktivitet fjernes. Disse inhibitorer er generelt termolabile og ødelægges ved varmebehandling ved 56 ° C i 45 minutter. Varmebehandling er tilstrækkelig til at fjerne ikke-speciFIC inhibitorer fra prøver, når H6 reassorterede vira anvendes som kilde til NA, men når H3N2-vira anvendes i ELLA, serumfaktorer, som binder til hæmagglutinin også interferere med ELLA og bør fjernes ved behandling med en lille mængde af sialidase før varmebehandling 9. For det andet, en stor mængde af antigen, dvs. reassortant H6Nx virus, bør ikke anvendes, da dette reducerer analysens følsomhed. Omhyggelig titrering af virus er derfor et vigtigt skridt; mængden af antigen, der anvendes i hvert assay skal give et signal, som er godt over baggrunden, og skal være inden for det lineære område af titreringskurven, dvs. skal signalet (optisk densitet) være proportional med virusfortynding.

Udover rutine serologi, kan ELLA anvendes til at vurdere antigene forskelle mellem nationale kontorer af årstidens influenzavirus. Disse oplysninger kan være meget nyttigt, når du vælger virusstammer for inklusion ets vaccinekandidater og vil fremme en større forståelse af immun pres, der resulterer i antigen drift af NA. Desuden kan antigen analyse af nationale kontorer fra svin eller aviær influenzavirus give vigtige oplysninger ved bestemmelse af pandemisk potentiale af nye stammer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coating buffer  KPL 50-84-01
 fetuin Sigma F3385
5x MES, pH 6.5  KD-Medical PBS-0134
CaCl2 Sigma C7902
30% BSA Sigma A8327
Tween 20 Sigma P1379
Lectin PNA-HRPO Sigma  L7759
PBS-T Sigma P3563-10PAK
o-Phenylenediamine dihydrochloride Sigma P8287
Phosphate-citrate buffer Sigma P4922
Sulfuric acid Sigma 258105
96-well  Maxisorp plates NUNC 439454
96-well round bottom well plates NUNC 267245
Plate sealers Thermo Scientific  14-245-192B
Chicken eggs Charles River Laboratories 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs
Multichannel pipette Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf 8 or 12 channel manual pipette 50-250 µl volume
Pipette tips Depends on pipettor brand Depends on pipettor brand
Plate reader, with 490 nm filter Perkin Elmer Victor V
Water bath set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
Water bath set to 56 °C Variety of suppliers  Variety of models
Refrigerator set to 4 °C Variety of suppliers  Variety of models
Incubator set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase. J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).
  2. Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus. J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).
  3. Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice. J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).
  4. Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man. N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).
  5. Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens. Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).
  6. Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).
  7. Couzens, L., et al. An optimized enzyme-linked lectin assay to measure influenza A virus neuraminidase inhibition antibody titers in human sera. J Virol Methods. 210C, 7-14 (2014).
  8. Eichelberger, M. C., et al. Comparability of neuraminidase inhibition antibody titers measured by enzyme-linked lectin assay (ELLA) for the analysis of influenza vaccine immunogenicity. Vaccine. 34 (4), 458-465 (2016).
  9. Westgeest, K. B., et al. Optimization of an enzyme-linked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A(H3N2) viruses. J Virol Methods. 217, 55-63 (2015).
  10. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  11. WHO. Manual of Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. , (2002).
  12. Cate, T. R., et al. A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects. Vaccine. 28 (9), 2076-2079 (2010).
  13. Couch, R. B., et al. Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase. J Infect Dis. 207 (6), 974-981 (2013).
  14. Fritz, R., et al. Neuraminidase-Inhibiting Antibody Response to H5N1 Virus Vaccination in Chronically Ill and Immunocompromised Patients. Open Forum Infect Dis. 1 (2), (2014).
  15. Fries, L. F., Smith, G. E., Glenn, G. M. A recombinant viruslike particle influenza A (H7N9) vaccine. N Engl J Med. 369 (26), 2564-2566 (2013).
  16. Monto, A. S., et al. Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection. J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).
  17. Fritz, R., et al. A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies. J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).

Tags

Immunologi influenza vaccine serologi neuraminidase antistof hæmning
Måling Influenza neuraminidase Inhibering Antistoftitere af Enzyme-linked lectin Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, J., Couzens, L., Eichelberger,… More

Gao, J., Couzens, L., Eichelberger, M. C. Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay. J. Vis. Exp. (115), e54573, doi:10.3791/54573 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter