Abstract
ノイラミニダーゼに対する抗体（NA）、インフルエンザウイルスに対する第二の最も豊富な表面タンパク質、インフルエンザに対する保護に寄与する。 （NI）を阻害NAを測定する従来の方法の抗体価は、日常的な血清学的検査のために実用的ではありません。このプロトコルは、酵素結合レクチンアッセイ（ELLA）、大型糖タンパク質基質、フェチュインでコーティングした96ウェルプレートで行われるNI力価を測定するための実用的な代替方法を記載します。最後から二番目の砂糖、ガラクトースを露出するNAを切断フェツインから末端シアル酸を、。ピーナッツ凝集素（PNA）は、ガラクトースに対する特異性を有するレクチンであるため、脱シアリル化の程度は、発色性ペルオキシダーゼ基質を添加したPNA-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して定量することができます。測定される光学密度はNA活性に比例します。 NI抗体価を測定するために、血清の連続希釈物を一定量のOでフェチュインでコーティングされたプレート上で37°CO / NでインキュベートしますF NA。 NA活性の≥50％の阻害をもたらす最高血清希釈の逆数は、NI抗体価として指定されます。 ELLAは、インフルエンザ感染またはワクチン接種後のヒト抗体応答のルーチン評価のための実用的なフォーマットを提供します。
Introduction
ノイラミニダーゼ（NA）はインフルエンザビリオンの表面上に発現される糖タンパク質です。その酵素活性は、感染細胞1,2-から新たに形成されたウイルス粒子の放出に必須です。活性NA阻害する抗体は、3つの動物モデルにおいてウイルス力価と疾患の症状を軽減し、人間4の疾患に対する抵抗性と相関します。ワクチン接種後のNA阻害（NI）の力価の増加は、したがって、NI抗体価を測定するための伝統的なアッセイはルーチン血清学のための実用的ではないので、しかし、多くの過去のインフルエンザ免疫原性試験は、このエンドポイントが含まれていなかった、ワクチンの有効性の指標を果たすことができます。
NI力価を測定するための従来の方法は、NA 1複合糖質から切断されたシアル酸の量を定量することに基づいています。多くの場合、チオバルビツール酸（TBA）法と呼ばれるこの方法は、シアル交流に変換する有害化学物質を使用して分析法により定量化することができる発色団へのid。アッセイは、個々のガラス管が使用されるため、多数のサンプルを試験するアッセイが煩雑製造には適していません。 96ウェルプレートにアッセイの小型化は、しかし、このアッセイは、依然として有害化学物質の使用を必要とし、したがって、理想的ではない、より実用的な形式5を提供します 。
NI抗体価を測定するための代替アッセイはLambré らによって開発された。6。この検定は、シアル酸がNAによって解放されたときに露出する糖タンパク質、ガラクトースの最後から二番目の糖の量を測定することによって酵素活性を定量化します。ピーナッツ凝集素（PNA）は、ガラクトースと特異的に結合するので、PNA - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）コンジュゲートは、比色読み出しを得るために使用することができます。測定される光学濃度は、試料中のNA活性に比例します。 NI力価が最高希釈を決定することによって測定されますNA活性の少なくとも50％を阻害する血清。この酵素結合レクチンアッセイ（ELLA）はNAのための基質として、フェチュイン、高度にグリコシル化された血清タンパク質でコーティングした96ウェルプレート中で行われます。
NI力価を測定するアッセイのための重要な考慮事項は、NAの源です。ワクチン接種を受けたか、感染した個体からの血清はNAにヘマグルチニン（HA）に対する抗体ならびに抗体が含まれているためです。 HAに結合する抗体は、NAの活性を妨害し、従って、HA特異的抗体による非特異的阻害を避けるために、NA又は抗原不適合HAを含む全ウイルスアッセイに使用されるべきで精製することができます。これらのウイルスは、古典的な再集合により、または逆遺伝学によって発生させることができます。目的は、標的株に関連していないサブタイプのHA、および研究されているウイルスのNAが含まれているウイルスを救出することです。この資料に記載されているアッセイは、回転によって生成されたA型インフルエンザウイルスを採用しますA型インフルエンザウイルス、サブタイプH1N1とH3N2 5から亜型H6のHAおよび目標とNAを含むように遺伝学をERSE。
ELLAと小型化TBAアッセイによって生成された結果は、同様のサブタイプ特異性と感度7で、これらのメソッドは同等で表示されます。 ELLAは、有害化学物質の使用を必要とするため、NI力価を測定するための好ましい方法であるしません。ほんの数ステップ（ 図1）と、実行するのは簡単です：サンプルを希釈し、追加され、フェチュインでコーティングされたプレートへのウイルス（NAのソース）に転送されます。プレートをO / Nインキュベートし、PNA-HRPOを加える前に洗浄されます。 2時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加します。呈色反応を停止させ、最終的には光学濃度が測定され、NAの活性の少なくとも50％阻害をもたらしたサンプル希釈の逆数は、50％終点力価として報告されます。 reproducibiliを評価するためのイントラ実験室での研究ELLAのtyが、プレート間の変動が最小であり、オペレータにオペレータ再現性が力価7でせ いぜい2倍の差が生じたことを示しました。 ELLA変動のその後の研究室間の研究では、異なる実験室で行われ、標準の包含は、さらに結果8のばらつきを低減することができるときアッセイは良好な再現性を持っていることを示しました。 ELLAは、前臨床および臨床インフルエンザワクチン研究7からの血清のパネルにNI抗体力価を測定することに適しており、また、インフルエンザウイルスのNA 9の間の抗原性の違いを評価するために使用することができます。
Protocol
鳥のコンポーネントを持つすべてのライブ再集合体ウイルスは、バイオセーフティーレベル2（BSL2）を使用して処理しなければならない米国農務省（USDA）と制度バイオセーフティ委員会によって使用が承認実験室での実践を-enhanced。
試薬および出発材料の作製
注：すべての試薬 の供給源を得るために、 材料表を参照してください。
- フェチュインでコーティングされたプレート
- 脱イオンH 2 Oで90 mlので10ml 10×コーティング緩衝液を混合することにより、コーティング緩衝液を調製
- -20℃で500μlのアリコートで1×コーティングバッファーとストア内の25ミリグラム/ mlのフェチュインのストック溶液を準備します。
- すぐに原液を1×コーティングバッファーを1,000倍希釈してプレートをコーティングする前に、フェチュインの作業溶液（25μg/ ml）を準備します。
- アルへフェチュインのワーキング溶液100μlを分配するためにマルチチャンネルピペットを使用して、高タンパク質結合能を有する96ウェルプレートのLウェル。
- その後、10のグループにプレートをスタックし、ホイルでラッププレートシーラーで各プレートをカバーしています。
- アッセイを行う前に、少なくとも18時間、冷蔵庫（2〜8℃）でプレートを置きます。
注意：プレートを、事前にコーティングされ、最大2ヶ月間2-8℃で塗布液を記憶することができます。
- 希釈剤
- ウイルスサンプルの希釈（2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）、pH6.5の、20mMのCaCl 2を、1％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.5％のTween 20）を、94.2 mlと混合するために希釈剤を調製するために1X MES、2ミリリットルのCaCl 2（10 mg / mlで）3.3 mlの30％BSAおよび0.5 mlのツイーン20でpH 6.5。
- 2ミリリットルのCaCl 2（10mg / ml）で94.7ミリリットルの1x MES、pHが6.5を混ぜ、PNA-HRPO（MES、20mMのCaCl 2を、1％BSAを用いてpH 6.5）のための希釈剤を準備し、3.3ミリリットルの30％BSAに。
- ノイラミニダーゼ（NA）
注：H6Nxウイルスreass公開された方法5,10以下ortants（これらはH6サブタイプのHAと関心のNAを持っている）、生成されます。彼らは、社内で使用できない場合、協力者から不活性化された再集合体ウイルスのバイアルを要求します。不活化ウイルスを使用する場合、調製物は、不活性化処理はNA活性に有意な影響を及ぼさなかったことを実証を通じてELLAでの使用に適していることを確認します。- -80℃できちんとした尿膜液0.5mlのアリコートを発育鶏卵で培養H6Nxウイルスのストックを11と格納します。
- 各アッセイのために、ウイルスの新しいアリコートを使用してください。アリコートを凍結し、解凍しないでください。
- 血清サンプルおよびコントロール
- 45-60分間56℃の水浴中で、全ての血清（試験サンプル例えば 、前およびワクチン接種後の血清、並びに対照、 例えば 、既知のNI力価を有するサンプル）を熱不活性化します。前または熱処理後の-20〜-70℃で血清を保管してください。 SAMP場合レは、サンプルを繰り返し凍結及び解凍されないように、凍結前に、いくつかのアリコートを行い、繰り返し試験します。
- （> 5ミリリットル）低力価および高力価と相互に少なくとも一つを識別するために、合理的な量で利用可能なヒト血清中のNI力価を測定するために、ELLAを使用してください。店舗≤-20°Cとして100μlのアリコートを、同じサンプルは、アッセイ性能を追跡するために多くのアッセイにおける対照として使用することができるようになっています。
- ピーナッツ凝集素（PNA） - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）
- PNA-HRPO希釈液（MES、 塩化カルシウムでpH 6.5および1％BSA）を準備します。
- 希釈液1mlにPNA-HRPO 1mgを溶解させることによって、PNA-HRPO原液を準備します。 -20℃で20から200μlのアリコートを保管してください。
- 新しいPNA-HRPOロットを使用する前に、テスト1：500、1：750、1：1000〜1：ポジティブコントロール（ウイルスのみ）で、最大ODをもたらす量と背景を識別するために、この試薬の2000希釈液（ウイルス）トンノー帽子は<正の信号の10％です。
- 2.1節で説明したように四重のウイルス希釈液を作ります。
- 2.2節で説明したように、フェチュインでコーティングされたプレートに希釈液を移し、37℃でプレートをインキュベートします。
- 16-18時間後、プレートを洗浄し、1追加：プレートの行を複製するPNA-HRPOの2,000希釈液（100μl/ウェル）：500、1：750、1：1000〜1。
- 2.3.9へのステップ2.3.4で説明したようにアッセイを完了します。
- > 10倍のバックグラウンドである最大信号が得られた希釈を選択するために、データを確認します。
- 使用直前に、1.5.3で同定されたPNA-HRPOの最適希釈を準備します。
- 洗浄緩衝液（0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4の0.05％ツイーン20（PBS-T））を大量に調製します。室温で保管してください。
- ペルオキシダーゼ基質（o-フェニレンジアミン二塩酸塩（OPD））を準備します。注：このような3,3のような代替ペルオキシダーゼ基質」、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）を使用することができます
- アッセイの日に100ミリリットルのdH 2 Oに1カプセルを溶解させることにより、リン酸-クエン酸緩衝液を準備します。
- 使用直前にリン酸 - クエン酸緩衝液20mlに1 OPD錠（10 mg）を溶解させます。
- 停止液（1 NH 2 SO 4）を準備：SO 4 973ミリリットルのdH 2 Oに27.2ミリリットルの株式98％のH 2を追加します。混合し、次いで、室温で保管してください。
ELLAで使用するためのNAの量の2決意
- 96ウェルプレートにウイルス希釈液を調製
- 列希釈プレートの1-11に120μlのサンプル希釈剤（セクション1.2）を分注します。
- カラム1に、追加の96μlのサンプル希釈剤を追加します。
- 解凍した後、これがウイルスの1:10希釈を与える列1のウェルを複製するために24μLを追加する前に、ウイルスのバイアルをボルテックス。
- 転送することにより、検体希釈液中のウイルスの連続2倍希釈液を作ります各希釈のためのクリーンなピペットチップを使用して、次の1つのウェルから120μlを。
- フェチュインでコーティングされたプレートへのウイルスの希釈を転送
- PBS-T（1.6節）で、フェチュインでコーティングされたプレートを3回洗浄した後、余分な洗浄バッファーを除去するために、吸水性ペーパータオルの上に各プレートをブロット。
- フェチュインでコーティングされたプレートの11列1に各ウェルに検体希釈液（セクション1.2.1）の50μLを加えます。
- （これらのウェルは、陰性対照である）カラム12にサンプル希釈液の100μlのを追加します。
- 転送列フェチュインでコーティングされたプレートの対応するウェルに希釈プレートの1月11日から希釈したウイルス50μlの。
- プレートシーラーでプレートをカバーし、その後、37℃の加湿インキュベーターに入れてください。
- 残りのステップは、（16-18時間後）を行うことする時間をメモします。
- NAの決意を完了
- インキュベーション（16〜18時間）完了すると、転送ベンチにプレートとプレートシーラーを削除します。
- PBS-T（1.7節）でプレートを6回洗浄した後、全ての液体がウェルから除去されていることを確認するために反転させ、吸収紙タオル上でバッチリ。
- すべてのウェルに（1.5.3で決定希釈で）100μl/ウェルPNA-HRPO溶液を添加し、室温で2時間静置します。
- インキュベーションが終了している15分未満前にセクション1.7で説明したように、OPD溶液を調製。
- PNA-HRPOを除去し、各ウェルにOPD基質100μlを添加する前に乾燥しみするために、テストプレートを3回洗浄します。
- 室温で正確に10分間プレートをインキュベートします。
- 1N硫酸100μl/ウェルを加えて反応を停止します。
- 0.1秒間490nmでの光学密度（OD）を測定するために、プレートリーダーを使用してください。
- 保存して、すべてのデータファイルをエクスポートします。
- 血清学のために使用されるウイルスの希釈を選択
- ODの490nmのをプロットしたグラフを描きますすなわち、線形領域）に比例したODをもたらすウイルスの希釈。
- 最大信号の約90％を与え、直線範囲内にあるウイルスの希釈を選択します。選択された希釈でのODはバックグラウンドシグナルよりも少なくとも10倍大きいことを確認してください。この特定のウイルスストックを採用し、すべてのアッセイのために選択されたウイルス希釈液を使用してください。
注：別の方法として、ウイルスのNA活性を測定し、ELLAに〜15-20μUNA活動/ミリリットルを使用しています。
3.酵素結合レクチンアッセイ
注： 図2笙希釈およびアッセイプレートのセットアップをWS。
- サンプル希釈液を作ります
- 氷の上で熱不活性化サンプルを置きます。
注：8の血清を各プレートに希釈することができます。 - プレート全体の1：10から始まる希釈液を使用して設定するために、列3-11内のすべてのウェルに120μlのサンプル希釈剤を追加します。
- コラム2に、検体希釈液の216μlの各サンプルの24μlを添加します。 3回上下にピペッティングすることで十分でサンプルを混合した後、次の列に120μLを移します。
- ピペットチップを変更した後、上下にピペッティングによりウェルの内容物を混合した後、次の列に120μLを移します。
- サンプルまでの手順を繰り返し3.1.4カラム11に転送されており、残りの120μlを破棄します。
- 氷の上で熱不活性化サンプルを置きます。
- フェチュインでコーティングされたプレートにサンプルおよびウイルスを追加
- ウイルス、渦のバイアルを解凍し、ステップ2で選択された希釈率で希釈剤（セクション1.2）でウイルスを懸濁します。4.2。各アッセイプレートのためのウイルスの少なくとも5ミリリットルを準備します。プレートを洗浄し、血清サンプルをプレートに添加されるまで、氷上で希釈したウイルスを保管してください。
- （一般的にプレート当たり4血清を適用）アッセイのために必要とされ、フェチュインでコーティングされたプレートの数を決定します。 PBS-Tでフェチュインでコーティングされたプレートを3回洗浄した後、各プレートを反転し、余分な洗浄バッファーを除去するために、吸水性ペーパータオルの上にブロット。
- 列2-11の重複ウェルに希釈プレートから各血清対照または試料希釈液50μlを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。
- 陰性対照（カラム12）を除く全てのウェルに希釈したウイルスの50μLを加えます。
- カラム1のウェルに検体希釈液の50μlのを追加し、カラム12にサンプル希釈液の100μlを添加します。
- プレートシーラーでウェルを覆い、その後静かにプレートの側面をタップするか、10秒間中程度の速度でプレートシェーカー上に置くことによって混合します。
- humidifにプレートを置き16-18時間、37℃でIEDインキュベーター。
- PNA-HRPOを追加し、2.3節で説明したようにアッセイを完了
4.データ解析
- アッセイ結果の妥当性を判断
- バックグラウンド値（ウイルスなし）は、ポジティブコントロール（ウイルスおよび血清なし）の10％未満であることを確認します。
- 同じ条件を用いて、異なるアッセイにおける対照血清ランの力価は中央値力価の2倍以内であることを確認します。
- 対照ウェルのOD測定値は（≤20％異なる）一貫性があり、重複したサンプルウェルのOD測定値は（≤10％異なる）一致していることを確認します。
- 無効な結果の根本原因を特定し、4.1.1、4.1.2または4.1.3に記載されている基準は、満たされていない場合、アッセイを繰り返します。トラブルシューティングをしようとすると、表1に示す要因を考慮してください。
- 50％エンドポイント力価を割り当て
- 各アッセイプレート、suコマンドのためのすべての測定値から平均バックグラウンド（ウェルに添加していない抗原）btract。
- 式を用いて、各血清希釈におけるパーセント阻害を計算する：100×（OD ウイルスのみ制御 - OD テストサンプル ）/ OD ウイルスのみを制御 。
- 最大信号の少なくとも50％の阻害をもたらした最高希釈を識別します。
- 50％終点力価として、この希釈の逆数を報告します。
注意：50％の阻害が任意の希釈で達成されなかった場合は、力価は、最初にテストした希釈よりも小さい例えば 、<10 1:10最初にテストした希釈があります。
- 50％阻害濃度を計算する（IC 50）
- 次のようにIC 50力価を決定するために、4パラメータロジスティック回帰を使用してください：すべての測定値から平均バックグラウンドを減算した後、回帰分析を行うプログラムに結果を転送します。
- 最大設定で、非線形回帰を使用してくださいウイルスのみの対照と最小値は、正確に50％阻害に対応する希釈を決定するために、ゼロに設定。
- IC 50力価として、この希釈の逆数を報告します。
Representative Results
本稿で提示アッセイは、図1に概略的に示されている。 図2は、96ウェルプレートのレイアウトを示し、そして血清サンプルの連続希釈物を、フェチュインでコーティングされたプレートにそれらを転送する前に、希釈プレート中で調製されていることを示しています。アッセイの重要なパラメータは、アッセイで使用されているノイラミニダーゼの量です。これは、再集合体ウイルスの滴定により決定されます。 H6N1およびH6N2ウイルスの力価測定の例が図3に示されている。H6N1の1:10 1:20 1:40希釈で、光学密度は、条件は、最大読み取りが得られるようにしたことを示し、同様でした。 1:80希釈で、読み出しは最大の約90％であり、従って、ウイルスのこの希釈液をその後のアッセイに用いました。血清滴定の例は、 図4に示されている。図ではあったヒト血清サンプルTIを示していますH6N1とH6N2ウイルスに対してtrated。各データ点は、血清の連続希釈によって達成されたNA活性の阻害パーセントを示します。 H6N1アッセイにおける最初の血清希釈は1:80でした。 ≥50％の阻害をもたらす最高希釈は、NIの抗体価であり、この例で示す血清の力価は、NC / 99のNA（N1）に対して640であるので、H6N2アッセイにおける血清の最初の希釈は5でした。およびWI / 05のNA（N2）に対して160。
図1. ELLAプロトコルの概略アッセイで使用するための抗原の希釈（ウイルス）の（A）決意（プロトコールのステップ2）：ウイルス希釈をすることによって測定フェチュインコーティングされたプレートとNAのアクティビティに追加されますプロトコルのステップ2.3で説明したようにPNA-HRPOとの結合を介して末端ガラクトース残基を定量化します。 （B 血清NI抗体価（プロトコールのステップ3）のグラム>）決意。サンプルを希釈し、その後、ウイルスを添加するフェチュインでコーティングされたプレートに移します。プレートは、O / N PNA-HRPOを追加し、呈色反応を生成するために必要な手順を完了する前にインキュベートします。最後に、呈色反応を停止させ、光学密度を測定しました。 NAの活性の少なくとも50％の阻害をもたらすサンプル希釈の逆数が50％終点力価として報告されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.図はELLAプレートが設定表示されます。血清サンプルの連続希釈は、希釈プレートで作られ、その後、フェチュインでコーティングされたプレートに移しています。 3fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
H6N1とH6N2ウイルス滴定の 図3. 例。H6N1 BR / 07の連続希釈液（AのNA /ブリスベン/ / 2007（H1N1）59は、青色のシンボルで示される）およびH6N2 UR / 07（NA Aの/ウルグアイ/ 716 /赤シンボルに示す2007（H3N2）） フェチュインでコーティングされたプレートで18時間インキュベートし、説明したようにPNA-HRPOとの反応性を決定しました。平均 2つのウェルのOD 490nmのウイルス希釈の逆数に対してプロットされます。 ELLAで使用するために選択H6N1の希釈は1:80だったとこれらの希釈液は、中の最大光学密度の約90％をもたらし、直線範囲内であったため、選択されたH6N2の希釈は1：40でした。3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
N1のNA（赤シンボル）とN2（青シンボル）のサブタイプに対する血清の 図4. 滴定。NA阻害力価は、再集合体ウイルスH6N1 NC / 99に対して測定した（A /ニューカレドニア/ 1999分の20（H1N1）のNAが含まれています）およびH6N2 ウィスコンシン/ 05（含まれているAのNA /ウィスコンシン/ 67/2005（H3N2））。血清の連続希釈物のパーセント酵素阻害を50％阻害を示す破線の水平線で示されています。 AののNAに対するNA阻害力価/ニューカレドニア/ / 1999 20（H1N1）（NC / 99）とA /ウィスコンシン/ 67/2005 2 9.3（640）と2 7.3であった（WI / 05）（H3N2）（それぞれ160）、。 VEの大きい方を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のrsion。
| 問題 | 考えられる原因（複数可） | 溶液 |
| 弱い信号またはウイルス滴定に達していない高原 | ⅰ）低NA酵素活性 ⅱ）ウイルスストック最適な条件の下で保存されていません | i）は、希釈剤は、NA活性のための最適なpHを有することを確認します。 pHが最適である場合、新たなウイルス株または濃縮ウイルスを調製 ⅱ）再増殖し、アリコートの株式; -80℃で保存する前にドライアイス上でスナップ凍結バイアル |
| 弱いか陽性細胞対照ウェル中の色なし | ⅰ）ウイルス希釈が誤って割り当てられました 凍結されたウイルスのアリコートにおけるii）のバイアル間変動 ⅲ）PNA- HRPOはあまり変性または希釈します ⅳ）OPDが正しく準備します | 私）;繰り返しウイルス滴定 ⅱ）全く変動がないことを確認するために、同じバッチからいくつかのバイアルを滴定します。著しい変動した場合、新鮮なアリコートを準備 ⅲ）PNA- HRPOをretitrateするために最適なウイルスの希釈を使用します ⅳ）OPDの新鮮な準備と繰り返し |
| 弱いまたは陽性対照血清による阻害なし | アッセイで使用ⅰ）多すぎるウイルス ⅱ）血清が悪化 | ⅰ）リピートウイルス滴定 ⅱ）新しい抗血清チェック貯蔵条件を取得 |
| 陰性対照血清による阻害 | 血清のⅰ）不適切な熱処理 アッセイで使用ⅱ）少なすぎるウイルス | ⅰ）血清の熱不活化を繰り返し ⅱ）リピートウイルス滴定 |
| 高いバックグラウンド | ⅰ）プレートの汚染の可能性を ⅱ）PNA- HRPOの濃度が低すぎる/高すぎます | ⅰ）たてコーティングしたプレートを使用して繰り返します ⅱ）使用する正しい希釈を識別するために、PNA-HRPOを滴定 |
| ウイルス滴定は、低希釈でNA活性の見かけの阻害を示します | I）の尿膜液は、NAのための基質を含んでいてもよいです | ⅱ）ショ糖クッションを通してペレット化されたウイルスを使用します |
性能基準を満たしていないアッセイの表1根本原因分析 。このテーブルには、ELLAを実行するときに発生する可能性のある問題の考えられる原因とソリューションを提供しています。
Discussion
酵素結合レクチンアッセイは、血清中のNI抗体価を測定するための実用的な方法です。 ELLAは、1990年にによってLambre ら 、説明したが、標準的な血清学的ア ッセイとして承認されるには、臨床サンプル12-16のNIの抗体価を測定するためのアッセイを実施する多数の研究室で、より最近てきました。いくつかの変形を測定するNI力価に大きな影響を与えることなく、プロトコルのステップにすることができます。例えば、PBSを希釈剤として使用することができるいくつかのNAサブタイプが有意に酵素活性が低下しているように、しかし、意思決定が行われる前に、推奨される緩衝液（MES、pHは6.5）、PBS中のウイルス滴定曲線を比較することは非常に有用ですpH値> 7.0。最適なpHが使用されていない場合は、ウイルスの最大シグナルは、アッセイにおける抗原の過剰量（ すなわち 、ウイルス）を用い、その結果、低減され得ます。これらの条件下で、アッセイは減少感度を有していてもよいです。
いくつかのノー未処理の血清をELLAで試験した場合のn-特異的阻害が観察されます。これは、熱不安定性β阻害剤の存在を示す、熱処理（56℃、45分間）により除去されます。インフルエンザHAの他の非特異的阻害剤（α及びγクラス）は、特にH3N2ウイルスの血球凝集および感染に関連して、記載されています。 H3N2ウイルスは、NAの供給源として使用される場合、実際に、非特異的阻害はまたELLAで観察されます。この阻害は、シアリダーゼ9少量の血清試料を処理することにより除去されます。
他の血清学的アッセイのためのように、陰性および陽性対照は、アッセイ性能を評価するための手段を提供するために、各アッセイに含まれるべきです。アッセイは、許容基準を満たしていない場合には、理由が特定されるべきである。 表1は、問題のトラブルシューティングに対処することができるアッセイにおける潜在的な手順のリストを提供します。
ELLAプロトコルプロブこのレポートでIDEDは、NAのソースとして、トリウイルスからのHA発信が含まれている再集合体ウイルスを使用しています。これは、許可証は、低病原性鳥ウイルスで動作するために必要とされるため、アッセイを行うには限界を提示します。 H6Nx再集合体ウイルスは、それらが不活性化された後、実験室間で共有することができます。したがって、再集合体ウイルスを生成する実験室の不活性化が完了したことを実証した後、アッセイは、コラボレーションを介して行うことができ、製剤は、そのNA活性を保持しています。 H6Nx再集合体ウイルスを使用する制約は、NAの非感染源を使用することによって克服することができます。他の人がウイルス様粒子（VLP）15を使用しているが、例えば、いくつかの研究室では、精製された組換えNA 17を使用しています。しかし、組換えNAもVLPはどちらも容易に入手可能であり、したがって、我々は、抗原的に不整合鳥HAでインフルエンザウイルスを継続して使用します。
伝統的なNI抗体力価を測定する方法は、いくつかの理由のために実用的ではありません。最も関心の呈色反応を生成するために必要とされている有害な化学物質です。また、サンプルの大容量が必要とされ、アッセイを行うために煩雑です。これとは対照的に、ELLAは、実行が容易であり、サンプルの妥当な数の滴定を可能にする形式です。アッセイの収量再現性のある結果7,8-ことELLA変動ショーを調べた研究からのデータ。 ELLAは、結果として可能NI抗体力価のルーチン測定をした、そして血清学的研究を行う研究室によって、より頻繁に使用されることが予想されます。
ELLAを行う際に考慮する必要があるいくつかの重要なステップがあります。まず、NA活性の非特異的阻害剤が除去されなければなりません。これらの阻害剤は、一般的に熱不安定性、45分間56℃で加熱処理することにより破壊されます。熱処理は、非特異を除去するのに十分ですH3N2ウイルスはELLAで使用される場合H6リアソータントウイルスはNAの供給源として使用されているサンプルからFIC阻害剤が、しかし、ヘマグルチニンに結合する血清因子もELLAを妨害し、シアリダーゼの少量での処理によって除去されるべきです治療9を加熱する前に。これは、アッセイの感度を低下させるように、第2、抗原、 すなわち 、再集合体H6Nxウイルスの過剰な量、使用すべきではありません。ウイルスの注意深い滴定が不可欠なステップです。各アッセイで使用される抗原の量は、すなわち 、十分な背景の上にある信号を提供しなければならない、と滴定曲線の直線範囲内である必要があり、信号（光学密度）は、ウイルスの希釈に比例する必要があります。
ルーチン血清学に加えて、ELLAは、季節性インフルエンザウイルスのNAとの間の抗原性の違いを評価するために使用することができます。包含aのウイルス株を選択するとき、この情報は非常に有用であってもよいですsのワクチン候補とNAの抗原ドリフトにつながる免疫圧力のより深い理解を容易にするであろう。また、ブタ又は鳥インフルエンザウイルスからのNAの抗原分析新興株のパンデミックの可能性を決定する際に重要な情報を提供することができます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating buffer | KPL | 50-84-01 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| 5x MES, pH 6.5 | KD-Medical | PBS-0134 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| 30% BSA | Sigma | A8327 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Lectin PNA-HRPO | Sigma | L7759 | |
| PBS-T | Sigma | P3563-10PAK | |
| o-Phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| Phosphate-citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| Sulfuric acid | Sigma | 258105 | |
| 96-well Maxisorp plates | NUNC | 439454 | |
| 96-well round bottom well plates | NUNC | 267245 | |
| Plate sealers | Thermo Scientific | 14-245-192B | |
| Chicken eggs | Charles River Laboratories | 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs | |
| Multichannel pipette | Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf | 8 or 12 channel manual pipette 50-250 µl volume | |
| Pipette tips | Depends on pipettor brand | Depends on pipettor brand | |
| Plate reader, with 490 nm filter | Perkin Elmer | Victor V | |
| Water bath set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models | |
| Water bath set to 56 °C | Variety of suppliers | Variety of models | |
| Refrigerator set to 4 °C | Variety of suppliers | Variety of models | |
| Incubator set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
References
- Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase. J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).
- Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus. J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).
- Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice. J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).
- Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man. N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).
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- Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).
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- Monto, A. S., et al. Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection. J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).
- Fritz, R., et al. A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies. J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).
