Introduction
中枢神経系のin vivoモデル（CNS）疾患は、脳の中に、このような薬物、病原体、またはエキソソームなどの外因性物質の効果的な送達を必要とします。したがって、理想的な配信方法は、動物に最小限の外傷を引き起こす神経ネットワークの整合性を維持し、脳の1の高い物質の濃度を達成する必要があります。
局所物質送達のいくつかの外科的方法は、内シース、脳内、及び脳室内注射またはインプラント2、3、4、5を含む、記載されています。これらのアプローチは、しかし、CNSへの外傷と考えられており、目的の物質の唯一の少量の投与を可能にしています。また、外因性の物質が急速に脳脊髄液6によって除去することができることが示唆されています7観察されています。それらは他の器官8,9による取り込みに起因するCNSに物質を送達するの低い有効性を示すものの、経口、肺、皮下、および静脈内経路などの全身送達方法は、より一般的に、動物モデルにおいて使用されています。したがって、これらの送達経路は、副作用および毒性10,11のリスクを増加させる、投与物質の高められた用量を必要とします。
ここでは、効果的に内頸動脈を介して脳に直接物質を提供するマウス輸液顕微法を、説明します。 CNSへの送達を標的化することに加えて、この技術は、正常な生理学的障壁を迂回し、従ってバイオロジカに非常に関連していません脳への治療薬または病原体の通路に関与リットルを処理します。
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Protocol
以下のプロトコルに関係する手順は、マイアミ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。また、すべての手順は、実験動物管理・インターナショナルの評価と認定協会（AAALAC）によって承認された施設で行われています。
手術のためのマウスの作製
- 実験室麻酔システムを使用して、酸素と混合イソフルランでマウスを麻酔。 （材料表を参照してください）商用マシンに2 L / minで％と酸素の流れ4-5との間で設定でイソフルランを使用してください。実体顕微鏡下で、手術の表面に動物を移し、ノーズコーンを使用して麻酔を維持（ - 2 L / minで2.5と酸素流量1.5を設定イソフルランを使用します）。
- あえぎなし2呼吸/秒 - マウス呼吸数は約1であることを確認してください。また、動物は、ウィスカ刺激反応とペダルrを示さないことを確認eflex（つま先ピンチ）。手術中の呼吸数と労力、少なくとも5分ごとに監視します。齧歯類麻酔監視のために特定の施設内動物管理使用委員会や獣医のガイドラインに従ってください。
- 乾燥を防ぐために無菌の綿棒を使用して、各眼に点眼潤滑剤の液滴を適用します。抗炎症や不快感を軽減するために鎮痛剤の投与が推奨されます。
- 動物がその背中の上に横たわると、ノーズコーンを使用して麻酔を維持します。
- エタノール70％とクロルヘキシジンと面積を3回拭くことによって、動物の首のエリアを清掃してください。 （詳細は下記）カミソリを使用して、動物の手術のエリアを剃ります。
一般的な頸動脈の2解剖（CCA）
- 実体顕微鏡下で全体のマイクロサージェリーの手順を実行します。手術用ハサミとピンセットを使用すると、胸骨上からトン以下に、首に浅い正中切開を行います彼の顎（約3〜4センチ）。
- 鉗子を注意深く別個の脂肪および結合組織を使用して気管を露出させます。
- さらにエリアを露出し、首を拡張するために、マウスの首の後ろに枕（丸い物体、直径約0.5cm）を配置します。
- 組織リトラクターやフックのいずれかを使用して組織を分離します。
- 気管の動物の左側には、慎重に左CCAを露出させるために結合組織を離れてピンセットで抜きます。
- 鉗子を使用して、慎重にCCAの分岐部を露出させるために、すべての結合組織、および外部と内部の両方の頸動脈の先頭を削除します。
物質の注入のためのCCAの調製
- 鉗子を使用して、外頸動脈（ECA）の下にナイロン縫合糸の二つのセグメント（約1cmずつ）挿入します。
- ECAの可能な限り最高の時点での恒久的な結び目を置きます。
- ECAの可能な最低点、すぐにCCA分岐上記の場所で取り外し可能な結び目。この結び目は、上部の結び目に比べて緩いすべきです。
- 可能な限り低い点で、血管クリップを使用して、CCAを閉じます。
- 血管クリップを使用して、内頸動脈（ICA）を閉じます。
- 使用して顕微解剖春のはさみは2ノットの間、ECA（約2mm）の小さなカットを行います。
ICA を介した 4物質注入
- 輸液システムを組み立てます。注入される物質を250μl（薬物、病原体、細胞外ベシクル、とりわけ）を含むツベルクリン注射器にと行っ切開部に静かにキャピラリー先端を挿入します。キャピラリーチューブの6インチ（X 1.2ミリメートル2.5ミリメートル理想的な寸法）を取り付けステップ3.6インチ
- それが分岐し、CCAを閉じるクリップの中間点に達するまで毛細管を下にスライドし続けます。
- 下ECAの結び目を下に接続します。結び目は、毛細管流動を可能にするのに十分な緩みとleakinを防止するのに十分タイトであることを確認しますグラム。
- ICAからクリップを削除します。
- ゆっくりと注射器ピストン可能物質の点滴毎秒約10μlに圧力を加えます。
5.注入後の手順
- バックICA上のクリップを配置します。
- 静かにキャピラリーチューブを取り外します。
- 完全に下ECAの結び目を下に接続します。
- ICAとCCAからクリップを削除します。
6.切開閉会と術後ケア
- 開創または組織フックと枕を削除します。
- 滅菌生理食塩水を使用して、きれいな縫合エリア。
- ナイロン縫合糸/針とピンセットを用いて切開を閉じます。
- 術後の不快感を軽減するために、抗炎症および鎮痛管理します。
- 少なくとも1時間とモニタ回復のための加熱パッド上に配置されたケージに動物を置きます。
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Representative Results
ここに記載のマウス注入顕微法は、非常に多用途であり、脳転移の形成1、12の代表的なモデルでの腫瘍細胞の送達を含む、直接脳内に異なる物質を送達するために使用されてきました。
この技術はまた、CNS内の異なる病原体の病理学的側面を評価するのに適しています。 HIV感染症のマウスモデルでは、注入手術はCCAに直接ウイルス粒子を注入するために使用しました。我々は、7日目、手術後、CNSは、リアルタイムPCRにより、HIVに対して陽性であることがわかりました。また、同側半球感染は6-10半球（ 図2）よりも高い折り目ました。
ここで説明する注入手術の別の適切なアプローチが提供することです CNSへの細胞外小胞（ECVs）、主にエキソソーム、。 図3は、注入後のマウスの24時間の同側の脳内の緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識されたCD63、エキソソームのマーカーの存在を示します。
図1：内頸動脈を介して注入の概略図。インサート（A）および（B）は、それぞれ、上下ノットの局在を示します。 （c）は、キャピラリチューブが挿通されるECAの小さな切り込み（灰色の線）を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2：HIV の検出リアルタイムPCRによる内頸動脈を介したウイルス注入後。バーは7日、左内頸動脈を介して、注入後のマウスから採取した平均HIV DNAレベルを示します。エラーバーは標準偏差を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：内頸動脈を介して ECVs注入後のマウス脳節描いたGFPタグ付きCD63、エキソソームマーカーの免疫蛍光。代表画像は、CD63を発現するECVs（緑）に関連したマウス脳微小血管を示しています。スケールバー：50μmです。= "_空白」を取得>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明する輸液顕微は、本体1、12を通じて不要な普及を防止する、CNSに様々な生物学的特徴の外因性物質を提供する上で非常に成功することが証明されています。血液脳関門の破壊は、いくつかのCNS関連疾患の病理学的特徴です。したがって、血液脳関門と外因性物質の関係を評価することは非常に重要かつ興味深いものです。
提示され、この手術モデルは、動物に限定外傷を引き起こし、非常に低い死亡率1、12に関連しています。また、手順は、CNSの機能又は脳血流1、12と干渉しません。この手順の最も重要な側面は、のみを許可すべきであるECAでの正しいカットを実行することですキャピラリーチューブを挿入します。広いカットが反対サイト上の他のECAの手術を必要とする、物質の漏れが注入されることになります。このような状況を防ぐために、キャピラリーチューブはカットよりも大きな直径を有しているべきであり、また動脈を通じて進入を容易にするために鋭いエッジを有するべきです。技術的側面について、完全に訓練された人員は、20分以内に、この手術を行うことができます。
この技術の主要な制限は、同じICAを通して一度だけ注入の可能性です。 CNS、使用すると、ここで説明1【選択技術は、BBB内に新しい正と負の相互作用に関する研究を支援するため、ならびに病原体を送達する可能性を有している、以前に記載されている必要があり、マイクロ容器に繰り返し物質送達のため、薬、および脳への生理的な薬。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
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