Introduction
Em modelos in vivo do sistema nervoso central (SNC) doenças requerem uma entrega eficaz de substâncias exógenas, tais como drogas, agentes patogénicos, ou exossomas, para o cérebro. Por isso, um método de entrega ideal deve causar o mínimo de trauma para o animal, preservar a integridade da rede neuronal, e alcançar concentrações elevadas de substâncias no cérebro 1.
Vários métodos cirúrgicos de distribuição de substâncias locais foram descritos, incluindo intra-bainha, intracerebral, e as injeções intraventricular ou implantes 2, 3, 4, 5. Estas abordagens, no entanto, são consideradas traumática do sistema nervoso central, e permitir a administração de apenas baixos volumes de a substância de interesse. Além disso, tem sido sugerido que as substâncias exógenas podem ser rapidamente removidos pelo fluido cerebrospinal 6 7 quando as técnicas acima mencionadas são empregues. Métodos de entrega sistêmicas, tais como oral, pulmonar, subcutânea e intravenosa, são mais comumente usados em modelos animais, embora eles apresentam baixa eficácia na entrega das substâncias para o SNC, devido à absorção por outros órgãos 8, 9. Portanto, estas vias de administração requerem doses elevadas de substâncias administradas, aumentando o risco de efeitos colaterais e toxicidade 10, 11.
Aqui, descrevemos uma técnica de microcirurgia infusão do mouse, o que efetivamente fornece substâncias diretamente no cérebro através da artéria carótida interna. Além de direccionamento da entrega ao CNS, esta técnica não ultrapassar barreiras fisiológicas normais e é portanto altamente relevantes para biological processos envolvidos nas passagens de agentes terapêuticos ou agentes patogénicos para o cérebro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os procedimentos envolvidos no protocolo seguinte foram aprovados pela Universidade de Miami Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). Além disso, todos os procedimentos estão sendo realizados em instalações aprovadas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório de Animal Care International (AAALAC).
1. Preparação de Ratos para Cirurgia
- Anestesiar rato com isoflurano misturado com o oxigênio, usando um sistema de anestesia laboratório. Use isoflurano na definição entre 4-5% e fluxo de oxigênio a 2 L / min na máquina comercial (Veja a Tabela de Materiais). Transferir o animal para a superfície da cirurgia, sob um microscópio estereoscópico, e manter a anestesia utilizando um cone de nariz (1.5 usar uma configuração de isoflurano - 2,5 e de oxigénio no fluxo de 2 L / min).
- Certifique-se de que a taxa respiratória do rato é de cerca de 1-2 respiração / seg sem ofegante. Além disso, garantir que o animal não apresenta reação estimulação bigodes e pedal reFlex (toe pitada). Monitorar a taxa de respiração e esforço durante a cirurgia, pelo menos a cada 5 min. Siga específica Animal Care Institucional e Comitê de Uso e diretrizes veterinários para monitorar anestesia roedor.
- Aplicar uma gota de lubrificante oftálmica em cada olho utilizando uma zaragatoa estéril, a fim de evitar a secura. A administração de anti-inflamatório e analgésico para aliviar o desconforto é recomendado.
- Com o animal deitado de costas, manter a anestesia utilizando um cone de nariz.
- Limpar a área do pescoço do animal, limpando a área três vezes com etanol a 70% e cloro-hexidina. Shave área de cirurgia do animal usando uma lâmina de barbear (detalhada abaixo).
2. A dissecção da artéria carótida comum (CCA)
- Execute o procedimento de microcirurgia inteira sob um microscópio estereoscópico. Utilizando uma tesoura cirúrgica e fórceps executar uma incisão na linha média raso no pescoço, a partir de cima do esterno até abaixo tele maxila (cerca de 3 a 4 cm).
- Utilizando uma pinça gordos cuidadosamente separado e tecido conjuntivo para expor a traqueia.
- Coloque um travesseiro (objeto redondo, cerca de 0,5 cm de diâmetro) na parte de trás do pescoço do rato para estender o pescoço, expondo ainda mais a área.
- Separa-se o tecido utilizando um afastador de tecido ou ganchos.
- No lado esquerdo do animal, da traqueia, cuidadosamente pinça para além do tecido conjuntivo para expor a CCA esquerda.
- Usando fórceps cuidadosamente remover todo o tecido conjuntivo para expor a bifurcação CCA, e o início de ambas as artérias carótidas interna e externa.
3. Preparação do CCA para perfusão Substância
- Insira dois segmentos de fio de náilon (cerca de 1 cm cada) sob artéria carótida externa (ECA), usando uma pinça.
- Coloque um nó permanente no ponto mais alto possível da ECA.
- No ponto mais baixo possível da ECA, imediatamente acima da bifurcação CCA, lugarum nó removível. Este nó deve ser solto em comparação com o nó superior.
- Feche a CCA usando um clipe de embarcação, no ponto mais baixo possível.
- Fechar a artéria carótida interna (ICA), utilizando um grampo navio.
- Usando microdissecção mola tesoura realizar um pequeno corte no ECA (cerca de 2 mm), entre os dois nós.
4. Infusion Substância via ICA
- Montar um sistema de infusão. Anexar 6 polegadas de tubulação capilar (dimensões ideais: 2,5 mm x 1,2 mm) para uma seringa de tuberculina contendo 250 ml da substância a ser infundido (drogas, patógenos, vesículas extracelulares, entre outros) e insira a ponta capilar suavemente para dentro da incisão realizada no passo 3.6.
- Continue a deslizar para baixo o tubo capilar até atingir um ponto médio entre a bifurcação e o grampo de fecho do CCA.
- Amarrar o nó ECA inferior. Verifique se o nó está solto o suficiente para permitir a fluidez capilar e apertado o suficiente para evitar leaking.
- Remover clipe do ICA.
- Gentilmente aplicar pressão para a substância pistão seringa permitindo a infusão de cerca de 10 l por segundo.
5. Procedimentos após a infusão
- Coloque o clipe de volta no ICA.
- Remova cuidadosamente o tubo capilar.
- Amarrar o nó ECA inferior completamente.
- Remova clipes do ICA e do CCA.
6. Incisão Encerramento e cuidados pós-operatórios
- Remover afastador ou tecido ganchos e travesseiro.
- área de sutura limpa utilizando solução salina estéril.
- Fechar a incisão usando nylon sutura / agulha e fórceps.
- Administrar anti-inflamatória e analgésica para aliviar o desconforto pós-operatório.
- Coloque o animal na gaiola colocada na almofada de aquecimento durante pelo menos 1 h e recuperação do monitor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A técnica de microcirurgia infusão rato aqui descrito é muito versátil e tem sido usado para fornecer substâncias diferentes diretamente no cérebro, incluindo a entrega de células de tumor em um modelo representativo da formação de metástases cerebrais 1, 12.
Esta técnica também é adequado para avaliar os aspectos patológicos de diferentes agentes patogénicos no SNC. Num modelo de ratinho de infecção por HIV, a cirurgia de infusão foi utilizada para injectar as partículas virais directamente no CCA. Nós descobrimos que 7 dias após a cirurgia, o CNS foi positivo para o HIV por PCR em tempo real. Além disso, a infecção hemisfério ipsilateral foi de 6-10 pregas mais elevado do que o hemisfério contralateral (Figura 2).
Outra abordagem adequada da cirurgia de infusão é descrito aqui para entregar vesículas extracelulares (ECV), principalmente exossomos, no SNC. A Figura 3 mostra a presença de CD63, um marcador para exossomas, marcado com proteína verde fluorescente (GFP) no cérebro ipsilateral de um rato 24 horas após a infusão.
Figura 1: Representação esquemática da perfusão através da artéria carótida interna. Na pastilha (a) e (b) mostram a localização dos nós superiores e inferiores, respectivamente; (c) representa o pequeno corte no ECA, através do qual é inserido o tubo capilar (linha cinza). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4804fig2.jpg "/>
Figura 2: Detecção de HIV por PCR em tempo real após a infusão viral através da artéria carótida interna. As barras indicam os níveis médios de ADN do VIH colhidas a partir de ratinhos de 7 dias pós a perfusão através da artéria carótida interna esquerda. As barras de erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imunofluorescência de CD63 rato Cérebro Seção Descrevendo GFP-etiquetado, um exossomo marcador, depois de ECV de infusão através da artéria carótida interna. A imagem representativa descreve um microvasos cérebro do rato associado com ECV CD63 expressando (verde). Barra de escala: 50 ^ m.obter = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A microcirurgia infusão descrito aqui tem provado ser muito bem sucedida no fornecimento de substâncias exógenas de vários recursos biológicos para o SNC, impedindo a divulgação indesejada por todo o corpo 1, 12. O rompimento da barreira sangue-cérebro é uma característica patológica de várias doenças relacionadas com o SNC; Por conseguinte, a avaliação da relação de substâncias exógenas com a barreira hemato-encefálica é de grande importância e interesse.
Este modelo de cirurgia apresentado provoca trauma limitada para os animais e é associado com uma mortalidade muito baixo, 12. Além disso, o processo não interfere com o funcionamento do SNC ou do fluxo sanguíneo cerebral 1, 12. O aspecto mais crítico deste procedimento é para executar o corte correto no ECA, que só deve permitir que oinserção do tubo capilar. Um corte mais amplo irá causar vazamento da substância a ser infundido, exigindo uma outra cirurgia ECA no lado oposto. A fim de evitar esta situação, o tubo capilar deve ter um diâmetro maior do que o corte, e deve também ter um bordo afiado de modo a facilitar a sua entrada através da artéria. Quanto ao aspecto técnico, uma pessoal completamente treinado é capaz de realizar esta cirurgia em 20 minutos.
A principal limitação desta técnica é a possibilidade de infusão apenas uma vez através do mesmo ACI. Para distribuição de substâncias repetido para o SNC, uma embarcação microport precisa de ser utilizado e tem sido descrita anteriormente uma técnica .O descrita aqui tem o potencial para contribuir para os estudos sobre novas interacções positivas e negativas no interior da BHE, bem como para entregar agentes patogénicos , drogas e agentes fisiológicos no cérebro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
- Frisella, W. A., et al. Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII. Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Wu, G., et al. Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates. Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).
- Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).
- Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain. J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).
- Pardridge, W. M. Drug and gene delivery to the brain: the vascular route. Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).
- Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells. Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).
- Huang, R. Q., et al. Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer. FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).
- Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain. Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).
- Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels. Biol Trace Elem Res. , (2015).
