Introduction
In vivo-modeller i centrala nervsystemet (CNS) sjukdomar kräver en effektiv leverans av exogena substanser, såsom läkemedel, patogener eller exosomes, in i hjärnan. Därför bör en ideal leveransmetod orsakar minimal skada på djuret, bevara integriteten av neuronala nätverk och uppnå höga substanskoncentrationer i hjärnan en.
Flera kirurgiska metoder för lokal substanstillförsel har beskrivits, bland annat inom mantel, intracerebral, och intraventrikulära injektioner eller implantat 2, 3, 4, 5. Dessa tillvägagångssätt är emellertid anses traumatisk för CNS, och tillåta administration av endast låga volymer av substansen av intresse. Vidare har det föreslagits att exogena ämnen kan snabbt avlägsnas genom cerebrospinalvätskan 6 7 när de ovan nämnda teknikerna används. Systemiska administreringsmetoder, såsom oral, pulmonell, subkutan och intravenös väg, är mer vanligt förekommande i djurmodeller, även om de uppvisar låg effektivitet i att leverera ämnen till CNS på grund av upptag av andra organ 8, 9. Därför är dessa sträckor för leveranser kräver förhöjda doser av de administrerade substanserna, vilket ökar risken för biverkningar och toxicitet 10, 11.
Här beskriver vi en mus infusionsmikrokirurgi teknik, som effektivt levererar ämnen direkt in i hjärnan via den interna karotisartären. Förutom att rikta leveransen till CNS, gör denna teknik inte kringgå normala fysiologiska barriärer och är därför i högsta grad relevant för Biological processerna i avsnitten i terapeutiska eller patogener in i hjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De förfaranden som är involverade i följande protokoll har godkänts av University of Miami Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). Dessutom är alla förfaranden genomförs i anläggningar som godkänts av Föreningen för bedömning och ackreditering av Laboratory Animal Care International (AAALAC).
1. Beredning av möss för kirurgi
- Söva musen med isofluran blandat med syre, med hjälp av en laboratorieanestesisystemet. Använd isofluran vid inställning mellan 4-5% och syre flöde på 2 l / min på den kommersiella maskinen (se Material tabell). Överför djuret till kirurgi yta, under ett stereomikroskop, och upprätthålla anestesi med hjälp av en noskon (använd isofluran inställning 1,5-2,5 och syre flöde vid 2 L / min).
- Se till att musen andningsfrekvensen är cirka 1-2 andning / sek utan flämtar. Dessutom se till att djuret inte uppvisar morrhår stimulering reaktion och pedal reFlex (tå nypa). Övervaka andningsfrekvens och ansträngning under operationen, åtminstone var 5 min. Följ specifika Institutional Animal Care och användning kommittén och veterinär riktlinjer för gnagare anestesi övervakning.
- Applicera en droppe oftalmisk smörjmedel på varje öga med hjälp av en steril bomullstopp för att förhindra torrhet. Administrering av anti-inflammatoriska och smärtstillande för att lindra obehag rekommenderas.
- Med djuret liggande på sin rygg, upprätthålla anestesi med hjälp av en noskon.
- Rengöra djurets halsområdet genom att torka området tre gånger med etanol 70% och klorhexidin. Raka djurets kirurgi området med hjälp av en rakkniv (se nedan).
2. Dissekering av gemensamma halspulsådern (CCA)
- Utför hela mikroförfarande under ett stereomikroskop. Användning av kirurgiska saxar och pincetter utföra ett grunt mittlinjeincision i nacken, från ovan bröstbenet till under than käke (ca 3 till 4 cm).
- Använd pincett försiktigt separat fet och bindväv att exponera luftstrupen.
- Placera en kudde (runda objekt, ca 0,5 cm i diameter) på baksidan av halsen på musen för att förlänga halsen, vilket ytterligare exponera området.
- Separera vävnad med hjälp av antingen en vävnads upprullare eller krokar.
- På djurets vänstra sidan av luftstrupen, noggrant plockar isär bindväven för att exponera den vänstra CCA.
- Använda pincett bort noggrant all bindväv att exponera CCA bifurkation och början av både externa och interna halspulsåder.
3. Beredning av CCA för substans Infusion
- Sätt två segment av nylon sutur (ca 1 cm vardera) under extern halspulsådern (ECA), med hjälp av pincett.
- Placera en permanent knut på den högsta punkten möjligt av ECA.
- Vid den lägsta punkten möjligt av ECA, omedelbart ovanför CCA bifurkationen, platsen borttagbar knut. Denna knut bör vara löst i förhållande till den övre knut.
- Stäng CCA använder ett fartyg klipp, till lägsta möjliga punkten.
- Stäng den inre halspulsådern (ICA) med hjälp av ett fartyg klipp.
- Använda microdissection våren sax utför ett litet snitt i ECA (ca 2 mm), mellan de två knop.
4. Substans Infusion via ICA
- Montera ett infusionssystem. Fäst 6 inches av kapillärrör (ideala dimensioner: 2,5 mm x 1,2 mm) till en tuberkulinspruta innehållande 250 ul av ämnet som skall tillföras (droger, patogener, extracellulära vesiklar, bland annat) och sätt den kapillära spetsen försiktigt i snitt utförs i steg 3,6.
- Fortsätt att glida ner kapillären tills den når en mittpunkt mellan bifurkationen och klämman stänger CCA.
- Binda den nedre ECA knut. Kontrollera att knuten är lös nog att låta kapillär fluiditet och tillräckligt stram för att förhindra Leaking.
- Ta klipp från ICA.
- Försiktigt tryck på sprutkolven tillåter substansen infusion på cirka 10 l per sekund.
5. Post Infusionsprocedurer
- Plats klipp tillbaka på ICA.
- Försiktigt bort kapillärröret.
- Surra lägre ECA knut helt.
- Ta bort klipp från ICA och CCA.
6. Snitt Stängning och postoperativ vård
- Ta bort upprullningsdon eller vävnadskrokar och kudde.
- Ren sutur området med steril koksaltlösning.
- Stäng snitt med hjälp av nylon sutur / nål och pincett.
- Administrera anti-inflammatoriska och smärtstillande för att lindra postoperativa obehag.
- Placera djur i bur placerad på värmedyna under minst en timme och övervaka återhämtning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musen infusionsmikrokirurgi teknik som beskrivs här är mycket mångsidig och har använts för att leverera olika substanser direkt in i hjärnan, inklusive leverans av tumörceller i en representativ modell av hjärn metastasbildning 1, 12.
Denna teknik är också lämplig för att bedöma de patologiska aspekterna av olika patogener i CNS. I en musmodell av HIV-infektion, var infusions kirurgi används för att injicera viruspartiklar direkt i CCA. Vi fann att 7 dagar efter operationen, CNS var positivt för HIV genom realtids-PCR. Vidare den ipsilaterala hemisfären infektionen var 6-10 veck högre än den kontralaterala hemisfären (Figur 2).
En annan lämplig metod för infusions kirurgi som beskrivs här är att leverera extracellulära blåsor (ECV), främst exosomes, in i CNS. Figur 3 visar närvaron av CD63, en markör för exosomes, märkt med grönt fluorescerande protein (GFP) i den ipsilaterala hjärnan hos en mus 24 timmar efter infusion.
Figur 1: Schematisk representation av Infusion via carotis interna. I insatsen (a) och (b) visar lokaliseringen av de övre och nedre knop, respektive; (c) representerar litet snitt i ECA, genom vilken kapillärröret infogas (grå linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4804fig2.jpg "/>
Figur 2: HIV Detection genom realtids-PCR efter Viral Infusion via carotis interna. Staplar indikerar genomsnittliga HIV DNA-nivåer som skördats från möss 7 dagar efter infusionen via den vänstra inre halspulsådern. Felstaplar visar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immunofluorescens av Mouse Brain avsnitt Visa den GFP-märkta CD63, en Exosome Marker, efter väsentliga klimatvariabler Infusion via carotis interna. Den representativa bilden visar en mushjärna mikrokärl i samband med CD63 som uttrycker väsentliga klimatvariabler (grön). Skala bar: 50 pm.få = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Infusionsmikro beskrivs här har visat sig vara mycket framgångsrik i att leverera exogena ämnen i olika biologiska funktioner i CNS, förhindra oönskad spridning i hela kroppen en 12. Störning av blod-hjärnbarriären är en patologisk kännetecken för flera CNS-relaterade sjukdomar; därför att bedöma förhållandet mellan exogena ämnen med blod-hjärnbarriären är av stor betydelse och intresse.
Denna operation modell som presenteras orsakar begränsad trauma för djuren och är förknippad med mycket låg dödlighet 1, 12. Heller förfarandet inte störa CNS-funktionen eller cerebralt blodflöde 1, 12. Den mest kritiska aspekten av denna procedur är att utföra en korrekt skuren i ECA, som endast bör tillåta deninsättning av kapillärröret. En bredare skuren kommer att orsaka läckage av det ämne som skall infunderas, som kräver en annan ECA kirurgi på motsatt platsen. För att förhindra denna situation bör kapillärröret har en större diameter än snittet, och bör också ha en skarp kant för att underlätta dess ingång genom artären. När det gäller den tekniska aspekten, är en fullt utbildad personal som kan utföra denna operation inom 20 minuter.
Den huvudsakliga begränsningen med denna teknik är möjligheten att infusion endast en gång genom samma ICA. För upprepad substansen leverans i CNS, ett fartyg mikroport måste användas och har beskrivits tidigare ett .Det teknik som beskrivs här har potential att bidra till studier om nya positiva och negativa interaktioner inom BBB, samt att leverera patogener , droger och fysiologiska medel i hjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
- Frisella, W. A., et al. Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII. Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Wu, G., et al. Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates. Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).
- Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).
- Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain. J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).
- Pardridge, W. M. Drug and gene delivery to the brain: the vascular route. Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).
- Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells. Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).
- Huang, R. Q., et al. Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer. FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).
- Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain. Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).
- Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels. Biol Trace Elem Res. , (2015).
