Abstract
Xenopus oocytter som et heterologt ekspresjonssystem for proteiner, ble først beskrevet av Gurdon et al. 1 og har vært mye brukt siden den ble oppdaget (Referanser 2 - 3, og referanser deri). En egenskap som gjør eggcelle attraktivt for utenlandske kanal uttrykk er dårlig overflod av endogene ionekanaler 4. Dette ekspresjonssystemet har vist seg nyttig for karakterisering av mange proteiner, blant dem ligand ionekanaler.
Ekspresjonen av GABAA-reseptorer i Xenopus-oocytter og deres funksjonelle karakterisering er beskrevet her, inkludert isolering av oocytter, microinjections med cRNA, fjerning av follikulære cellelag, og rask løsning forandringer i elektrofysiologiske eksperimenter. Prosedyrene ble optimalisert i dette laboratoriet 5,6 og avviker fra de som brukes rutinemessig 7-9. Tradisjonelt er blottet oocytter forberedtmed en forlenget kollagenase behandling av ovarieceller fliker ved RT, og disse utarmede oocytter blir mikroinjisert med mRNA. Ved hjelp av de optimaliserte fremgangsmåter, har forskjellige membranproteiner blitt uttrykt og undersøkt med dette system, slik som rekombinante GABA A reseptorer 10-12, humane rekombinante klorid kanaler 13, trypanosom kaliumkanaler 14, samt en myo-Inositol transportør 15, 16.
Metodene som er beskrevet her, kan anvendes for ekspresjon av hvilket som helst protein av valg i Xenopus oocytter, og den raske oppløsningen endringen kan brukes til å studere andre ligand-gated ionekanaler.
Introduction
Xenopus oocytter er mye brukt som et uttrykk system (Referanser 2 - 3, og referanser deri). De er i stand til å skikkelig sette sammen og innlemme funksjonelt aktive multisubunit proteiner i sine plasmamembraner. Ved hjelp av dette system, er det mulig å undersøke funksjonelt membranproteiner alene eller i kombinasjon med andre proteiner, for å studere egenskapene til muterte, kimære eller sammenkjedet proteiner, og for å screene potensielle medikamenter.
Fordeler ved bruk av oocytter i forhold til andre heterologe ekspresjonssystemer som omfatter den enkle håndtering av kjempeceller, den høye andelen av celler som uttrykker fremmede genetiske informasjon, kan den enkle kontroll av miljø i eggcelle ved hjelp av bad perfusjon, og kontroll av membranpotensialet .
Ulempen med dette ekspresjonssystem er det sesongvariasjon observert i mange laboratorier 17-20. Grunnen til denne variasjonener langt fra klart. I tillegg er kvaliteten av oocytter ofte observert å variere sterkt. Tradisjonelle metoder 7-9 har tatt med isolering av eggstokk lapper, eksponering av eggstokk lapper til collage for noen timer, valg av utarmede oocytter, og eggcelle mikroinjeksjon. Her er en rekke alternative, raske prosedyrer rapportert som har tillatt oss å jobbe med dette uttrykket system for mer enn 30 år uten sesongvariasjon og liten variasjon i eggcelle kvalitet.
De modifiserte og forbedrede fremgangsmåter som er beskrevet her for isolering av oocytter, mikroinjeksjon med cRNA, og fjerning av follikulære cellelag kan anvendes for ekspresjon av hvilket som helst protein av valg i Xenopus oocyte. Den meget enkel metode for rask løsningsendringer i mediet rundt en oocytt kan påføres på studiet av en hvilken som helst ligand-gated ionekanal og av bærere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk har blitt godkjent av den lokale komiteen av Canton Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15).
1. Utarbeidelse av Xenopus oocytter
- Opprettholde frosker (Xenopus laevis) på et 12 h / 12 timers lys / mørke syklus i vann som er strengt holdt ved 20 ° C.
- Fjern fliker av eggstokkene fra kvinnelige frosker 9.
MERK: fjerning av lappene er en stimulans for regenerering, og ofte kvaliteten på ubefruktede egg øker med kirurgi. Eggcelle er dekket av en vitelline lag, et lag av hårsekkceller og bindevev inneholdende blodkar 21. Hele strukturen er kalt "follicle". - Plasser flikene av eggstokkene som er tettpakkede med follikler som inneholder eggceller i sterile Barth Saline 7 (MBS) supplert med penicillin og streptomycin (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mmNaHCO3, 0,82 mM MgSO4, 0,41 mM CaCl2, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre; HEPES (pH 7.5, NaOH), 100 mikrogram / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin).
- Single-out scenen V-VI 21 follikler. Hold eggstokk lapp med pinsett. Senk platinaslynge (figur 1) i løpet av folliklene og forsiktig trekke løkken for å forstyrre bindevev inneholdende den follicle fra eggstokken vev.
MERK: Stage V-VI 21 follikler er preget av sin størrelse (1,0 til 1,2 mm i diameter) og ved god kontrast mellom det mørke pigmenterte dyr halvkule og gulaktig vegetal halvkule. - Overfør bare friskere follikler (dvs. perfekt sfæriske og med intakt pigmentering) til en 35 mm diameter petriskål ved hjelp av en plast Pasteur pipette (klippe ryggen til en åpningsdiameter på 1,5 mm).
Merk: mikroinjeksjon system som beskrives her er avledet fra det rapportert av Kressmann og Birnstiel 22.
- Fremstille CRNAs fra de respektive cDNA som koder for underenhetene av α 4 β 2 δ GABAA-reseptoren ved in vitro-transkripsjon, tilsetning av et poly (A +) hale, og RNA kvantifisering ved gelelektroforese 23.
- Fremstille mikroinjeksjon pipetter fra borsilikatglass kapillærer (1,0 mm ytre diameter (OD), 0,58 mm indre diameter (ID), 100 mm lengde) ved hjelp av en mikropipette avtrekker. Brekke av tuppen av glasskapillærer under et mikroskop ved hjelp av en mikromanipulator og filament for å skape en spiss diameter på 12 - 15 um med en avfaset spiss.
- Fylle mikroinjeksjon pipetter med parafinolje med en 10 ml sprøyte, og deretter montere mikroinjeksjon pipetten på en homebuilt microinjection apparat (figur 2).
MERK: homebuilt olje hydraulisk injeksjonsapparat består av en grill motor som styres av en fotpedal bryter. En ekstra bryter skifter dreiningen modusen av motoren. Denne motoren driver en mikrometer skrue (0,5 mm / turn) som avanserer eller trekker stempelet av en 10 mL glassprøyte. Injeksjonen er ved en hastighet på ca. 3 rpm og en 0,5 omdreining tilsvarer en 50 nL injeksjon i en follikkel. Tuppen av sprøyten er koblet til tykkveggede polytetrafluoretylen rør som selv er koblet til injeksjonsnålen av et meget kort stykke av Tygon-rør. Injeksjonen kapillær er holdt av en chuck som styres av en micromanipulator. Hele systemet er fylt med parafinolje. Eventuelle luftbobler bør unngås, ettersom de vil svekke innsprøytningssystemet. Oppsettet er tent med en kald lyskilde. Et stereomikroskop er nødvendig for optisk kontroll. Follikler er visualisert under kaldt lys med en stereomicroscope (40X forstørrelse). Utførelse av injeksjons oppsettet er testet ved injeksjon av radioaktivt sporstoff i Xenopus oocytter. Et volum på 45 - 55 nL skal leveres pr injeksjon. - Ved hjelp av en pipette med en steril plastspiss, teste oppsettet ved å plassere en dråpe med sterilt vann på ren innsiden av en fuktbestandig termoplast (2 x 2 cm). Dypp tuppen av injeksjon pipetten inn i denne dråpen, og deretter slå av motoren for å trekke stempelet (undertrykk inne i injeksjons pipette).
MERK: Vann bør gå inn i pipetten og danner en synlig grensesnitt med oljen. - Trekke spissen av pipetten fra dråpen og anvende positivt trykk på innsiden av injeksjons pipetten. En vanndråpe skulle danne seg spissen av pipetten injeksjonen.
- Klargjør for injeksjon av folliklene ved å stille dem opp sammen med det vegetabilske polene peker oppover i mellomrommene av et nylonnett (G: 0,8 mm) er limt til bunnen av en Petri tallerken (60 mm) dekket med MBS.
- Tilsett 2 mL av mRNA ved hjelp av en pipette med en steril plastspiss på ren innsiden av en termoplast. Ta opp mRNA inn i injeksjons pipetten ved å tilføre negativt trykk til innsiden av injeksjons pipetten.
- Plasser injeksjon pipette over en individuell hårsekken ved hjelp av micromanipulator.
- Sett injeksjonsnålen inn i sentrum av det vegetabilske pol og injisere 50 nL av mRNA ved en strømningshastighet på 0,6 mL / min ved å anvende positivt trykk på innsiden av pipetten. Vent 5 - 10 sekunder før du fjerner injeksjon pipettespissen fra follikkelen å unngå mRNA flukt.
MERK: mRNA skal injiseres inn i det vegetabilske (gulaktig) pol for å unngå injeksjon inn i kjernen, som ligger i dyret halvkule. - Overfør de injiserte follikler til en ny petriskål (35 mm) fylt med 2 ml av MBS. Sett fatet i en vinkjøler innstilt på 18 ° C. Inkuber injisert follicles for en -7 d før opptak, avhengig av identiteten til den nylig uttrykte protein.
3. Stripping av follikler (figur 3)
MERK: Som nevnt ovenfor, eggcelle er dekket av et lag vitelline, hårsekkceller og bindevev, som inneholder blodkarene 24, er kjent som en "follikkel." Alle lag, unntatt for vitelline lag, som gir mekanisk stabilitet uten å hindre adgang av løsninger til celleoverflaten, må fjernes før elektrofysiologiske eksperimenter. Hårsekken uten de omkringliggende cellelagene har tidligere blitt kalt en "ribbet" eggcelle 25. Dette trinnet blir vanligvis utført på den samme dag som de elektrofysiologiske eksperimenter.
- Overføring ti injisert follikler til et borsilikat glassrør inneholdende 0,5 ml av MBS, 1 mg / ml kollagenase, og 0,1 mg / ml trypsin-inhibitor. Dyppe røret i et vannbad som ble holdt ved 36 ° C. Inkuberfollikler for 20 min og riste rørene og til.
- Skyll folliklene ved å overføre dem til et annet rør inneholdende 1 ml av MBS ved RT. La dem i røret for omtrent 10 sek.
- Overfør follikler til et tredje rør inneholdende 0,5 ml konsentrert dobbelt MBS inneholdende 4 mM Etylenglykol-bis (2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraeddiksyre (EGTA), og inkuber dem i 4 minutter ved RT. Rist rør av og til.
MERK: hyperton oppløsning (dobbelt konsentrert MBS) blir brukt til å indusere krymping av oocyttene innenfor follicle cellelag, for derved å løsne follikkelcelleadenom lag fra en oocytt; EGTA blir tilsatt for å inhibere kollagenase aktivitet. - Skyll folliklene ved å overføre dem til et annet rør inneholdende 1 ml av MBS ved RT. La dem i røret for omtrent 10 sek.
- Overfør oocyttene til en petriskål (35 mm diameter) inneholdende 2 ml av MBS. Under en stereomikroskop, skiller de ytre konvolutter fra folliklene vedbare skyve det blotte eggcelle unna ved hjelp av platina loop.
MERK: De ytre konvolutter av ubefruktede egg feste fast til kultur fatet og kan lett skilles fra eggceller. Noen oocytter vil spontant miste sine ytre konvolutter og vil bli gjenopprettet som blottet eggceller. Denne fremgangsmåten resulterer i et forholdsvis stabilt preparat som holder den sfæriske utseende av oocyttene.
4. Rask Løsning Bytt rundt eggcelle
- Utføre en spenning klemme eksperiment som beskrevet 9,26.
- Endre løsning av tyngdekraften-matet perfusjon system ved å snu perfusjon brytere som kreves av eksperimentet.
- Påfør perfusjon oppløsningen ved 6 ml / min gjennom et glass kapillar med en indre diameter på 1,35 mm, munn som er anbrakt omtrent 0,4 mm fra overflaten av eggcelle, for å tillate raske endringer i agonist-konsentrasjon rundt oocyte.
MERK: Endringstakten har vært tidligere anslagd som 70% på mindre enn 0,5 s 27.
- Påfør perfusjon oppløsningen ved 6 ml / min gjennom et glass kapillar med en indre diameter på 1,35 mm, munn som er anbrakt omtrent 0,4 mm fra overflaten av eggcelle, for å tillate raske endringer i agonist-konsentrasjon rundt oocyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenopus oocytter ble mekanisk blinket ut ved hjelp av en platina sløyfe (figur 1). Oocyttene ble mikroinjisert med mRNA som koder for GABAA-reseptorsubenheter a 4, P 2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / eggcelle (figur 2). Etter 4 d, ble follikkelcelleadenom lag fjernet (figur 3). Oocytter ble spenning fastklemt ved -80 mV og utsatt for økende konsentrasjoner av γ-aminosmørsyre (GABA) i nærvær av 1 uM 3α, 21-dihydroksy-5α-pregnan-20-on (THDOC), en potent positiv allosterisk modulator av GABAA-reseptoren. Figur 4A viser opprinnelige aktuelle traser registrert i et slikt eksperiment. Figur 4B viser fremkalte strømamplitude avhengig av GABA-konsentrasjoner. Dette tillater bestemmelse av sensitiviteten av denne subenhet kombinasjon overfor GABA. De enkelte kurvene varmontert og standardisert til jeg max og deretter gjennomsnitt. Den ligning som ble anvendt var I (c) = I max / (1+ (EC 50 / c) n-), hvor c er konsentrasjonen av GABA, EC 50 konsentrasjonen av GABA (i nærvær av 1 uM THDOC) å utløse en halv -maximal strømamplitude, er jeg maks den maksimale strømamplituden, i er strømmen amplitude, og n er Hill-koeffisienten. EC 50 av den α 4 β 2 δ GABAA-reseptoren utgjør 0,41 ± 0,12 uM, og n var 0,76 ± 0,04.
Figur 1: Platinum Loop. Platina wire loop nevnt i protokollen trinn 1.4. Platinum er et metall som kan bøyes uten å produsere fliser, og det klistrer seg ikkebiologisk materiale. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Homebuilt Mikroinjeksjon Apparatus. Apparatet er beskrevet i protokollen trinn 2. a, grill motor; b, mikrometer skrue; c, spring mellom sprøyte og stempelet; d, 10 ul glassprøyte; e, tykke vegger polytetrafluoretylen rør; f, hånd chuck; g, injeksjon pipette; h, stereomikroskop; og jeg, motorisk kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Skjema Viser den Defolliculation av en oocytter. Oocyttene inkuberes først i en kollagenaseoppløsning i et vannbad ved 36 ° C i 20 min. Oocytter ble deretter vasket i en modifisert Barth-medium. Den endelige inkuberingen trinnet er i en hypertonisk EGTA-løsning ved romtemperatur i 4 min. Som et resultat, er bindevevet og de hårsekkceller fjernet for å gi plass til den ribbet oocyte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Gjeldende spor fra en to-elektrode Voltage Clamp eksperiment. EN, Gjeldende spor fra en GABA-konsentrasjon responskurve i presence av 1 uM THDOC oppnådd fra en Xenopus oocytt som uttrykker α 4 β 2 δ GABAA-reseptoren. Linjene indikerer tidsperioden for GABA / 1fiM THDOC perfusjon. Økende konsentrasjoner av GABA ble påført på oocytter, og de tilsvarende strømamplituder ble bestemt. GABA-konsentrasjoner er angitt over søylene. B, Midlede konsentrasjons-responskurver for den α 4 β 2 δ GABAA-reseptoren. Individuelle kurver ble først normalisert til den maksimale montert strømamplituden og ble deretter beregnet. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SD, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μL, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, G: 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
- Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
- Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
- Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
- Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
- Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
- Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
- Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation'A Practical Approach. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M.
- Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943 (2016).
- Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
- Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
- Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
- Wu, M., Gerhart, J.
- Gurdon, J. B. American clawed frogs. Methods in developmental biology. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).
- Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
- Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
- Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).
- Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
- Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
- Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
- Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
- Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).
