Summary
In het hart, moleculaire gebeurtenissen coördineren van de elektrische en contractiele functie van het orgel. Een set van de lokale veld fluorescentiemicroscopie technieken hier gepresenteerde maakt de registratie van cellulaire variabelen in intacte harten. Het identificeren van mechanismen voor het definiëren van de hartfunctie is van cruciaal belang in het begrijpen hoe het hart werkt onder pathologische situaties.
Abstract
In het hart, zijn moleculaire signalering studies meestal uitgevoerd in geïsoleerde myocyten. Veel pathologische situaties, zoals ischemie en hartritmestoornissen kunnen alleen volledig worden begrepen op het gehele orgaan niveau. Hier presenteren we de spectroscopische techniek van het lokale veld fluorescentie microscopie (LFFM) dat de meting van cellulaire signalen in het intacte hart toelaat. De techniek is gebaseerd op een combinatie van een Langendorff geperfundeerde hart en optische vezels fluorescentiesignalen nemen. LFFM heeft verschillende toepassingen op het gebied van cardiovasculaire fysiologie het hart te bestuderen onder normale en pathologische omstandigheden. Meerdere cardiale variabelen kunnen worden gevolgd met verschillende fluorescente indicatoren. Deze omvatten cytosolisch [Ca 2+], intra-sarcoplasmatisch reticulum [Ca 2+] en membraan potentials. De exogene fluorescerende probes zijn enthousiast en de uitgezonden fluorescentie gedetecteerd met drie verschillende arrangementen van LFFM epifluorescentie technieks in dit document. Het centrale verschil tussen deze technieken zijn de soort lichtbron voor excitatie en onderweg het excitatielicht wordt gemoduleerd. De gepulseerde LFFM (PLFFM) maakt gebruik van laser lichtpulsen, terwijl continue golf LFFM (CLFFM) maakt gebruik van continue laserlicht voor excitatie. Tenslotte, light-emitting diodes (LED's) gebruikt als een derde lichtbron. Deze niet-coherente opstelling wordt genoemd gepulseerd LED fluorescentie microscopie (PLEDFM).
Introduction
Het hart is het centrale orgaan van het cardiovasculaire systeem. Samentrekking van het hart wordt geïnitieerd door een toename van intracellulaire [Ca2 +]. De relatie tussen de elektrische prikkelbaarheid en veranderingen in de intracellulaire Ca 2+ release van oudsher bestudeerd in enzymatisch gedissocieerde cellen 1, 2. Echter, hartcellen elektrisch, metabolisch en mechanisch gekoppeld 3, 4. Wanneer die de myocyten zijn niet alleen fysiek ontkoppeld, maar myocyten uit verschillende lagen worden gemengd tijdens de dissociatie 5. Verder ondanks de enorme voordelen die uit de studie van geïsoleerde cellen ontstaan onder voltage clamp omstandigheden, 6, 7, 8 de intrinsieke aard van het hart als een syncytium elektrische always stelt de vraag hoe functioneel verschillende worden gescheiden cellen van de aanwezigen in het weefsel 3.
In dit manuscript beschrijven we de vooruitgang in de kennis van hartfysiologie verkregen door middel van lokale veld fluorescentiemicroscopie (LFFM) technieken in het intacte hart. LFFM gebruikt fluorescente indicatoren voor verschillende fysiologische variabelen zoals cytosolische Ca2 +, intra sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca2 + en membraanpotentiaal meten. Deze metingen kunnen gelijktijdig en in combinatie verkrijgbaar ventrikeldruk 9, 10, 9 elektrocardiogrammen, elektrische actiepotentialen (AP's), ionenstroom opnames en flitsfotolyse gekooide verbindingen 4, 11. Bovendien kunnen deze metingen worden verkregen door pacing het intacte hart op hogere frequenties closer om fysiologische tarieven. Hoewel verschillende artikelen 9, 11, 12, 13, 14 zijn door de groep met behulp van LFFM technieken gepubliceerd, heeft het vermoeden van de technische complexiteit in verband met deze techniek het massale gebruik voorkomen in het bestuderen van ex vivo fysiologische verschijnselen in het hart en andere organen.
LFFM de techniek (figuur 1) is gebaseerd op epifluorescentie metingen verkregen met een multimode optische vezel in contact met het weefsel. Als contact fluorescentie beeldvormende techniek, de optische resolutie hangt af van de diameter en de numerieke apertuur (NA) van de vezel. Een hogere NA en kleinere diameter van de vezel wordt de ruimtelijke resolutie van de meting verhogen. NA en vezeldiameter kan variëren 0,22-0,66 en van 50 urn tot 1 mm, respectievelijk. Invouwen het NA zal de signaal-ruisverhouding (S / N) te verbeteren door aanvaarding fotonen aankomen uit een grotere ruimtehoek. Om te werken als een epifluorescentie inrichting wordt het licht gefocusseerd op de optische vezel met een asferische lens of een epifluorescentie doelstelling waarbij de NA van de lens en de vezel spel. Deze matching maximaliseert de energie-overdracht voor excitatie en voor het verzamelen van de rug van de fotonen uitgezonden door het fluorofoor.
Om de exogene fluorescente indicatoren in het weefsel prikkelen geladen kunnen verschillende lichtbronnen en verlichtingsmodi worden gebruikt. Onze baanbrekende studies met behulp van de gepulste lokale veld fluorescentiemicroscopie 3, 12 (PLFFM) gebruik van een low-cost picoseconde laser (figuur 1a, PLFFM). Dit type lichtbron biedt het enorme voordeel van het opwekken van een grote fractie van fluorofoor moleculen onder de verlichtingsgebied zonder significante bleken van de kleurstof te wijtende korte pulsduren 12. Bovendien kan het gebruik van ultrakorte pulsen mag de beoordeling van de fluorescentie levensduur van de kleurstof 12. De fluorescentie levenstijd is een eigenschap die kan worden gebruikt om de fractie van kleurstofmoleculen gebonden aan Ca2 + te kwantificeren. Helaas, de temporele jitteren van de pulsen en variaties in amplitude van puls-tot-puls kan zij de toepassing van deze experimentele strategie op gevallen waarin de verandering in fluorescentie door de ligandbinding aan de kleurstof groot.
Continuous Wave (CW) lasers worden meestal gebruikt als de belangrijkste lichtbron in LFFM (figuur 1b, CLFFM). De laserstraal kan continu branden het weefsel of kan ferroelektriciteit worden gemoduleerd. De ferroelektrische van de bundel maakt de generatie van microseconden lichtpulsen. Deze modulatie kan worden gecontroleerd door externe hardware. Deze procedure vermindert niet alleen drastisch tHij tijdelijke jitteren van lichtpulsen, maar maakt het ook mogelijk het mengen van bundels van verschillende golflengten. Het mengen van bundels gebeurt door multiplexen stralen van verschillende lasers. Bijgevolg kunnen meerdere kleurstoffen met verschillende spectrale eigenschappen worden opgewekt op de metingen van verschillende fysiologische variabelen te voeren, bijvoorbeeld Rhod-2 voor cytosolische Ca2 +, MagFluo4 voor intra-SR Ca2 + en di-8-ANEPPS voor membraanpotentiaal.
Hoewel lasers aanwezig zijn verschillende voordelen als lichtbron in LFFM, kunnen andere soorten lichtbronnen worden gebruikt, waaronder light-emitting diodes (LED's). In dit geval, de excitatie lichtbron bestond uit een InGaN LED (figuur 1c, PLEDFM). LEDs worden fotonen spontaan afgegeven wanneer elektronen uit de geleidingsband recombineren met gaten in de valentieband. Het verschil met solid-state lasers is dat de emissie niet gestimuleerd door andere fotonen. Dit resulteert in een niet-coherente bundel eneen bredere spectrale emissie voor LEDs.
Verschillende soorten high power LEDs kunnen worden gebruikt. AP opnamen behulp di-8-ANEPPS en Ca 2 + transiënten opgenomen middels Fluo-4 of Mag-Fluo-4, we een LED die een gemiddelde piek emissie bij 485 nm (blauw) en een halfwaardebreedte van 20 nm gebruikt (figuur 1d). Voor Ca2 + transiënten opgenomen met Rhod-2, de LED had een typische piek emissie bij 540 nm (groen) en een halfwaardebreedte van 35 nm (figuur 1d). LED's uitzenden in een band golflengte en vereisen daarom filters om hun spectrale emissie te beperken. Bovendien kan gepulseerd licht bij een frequentie van 1,6 kHz met een duur van 20 ps worden gegenereerd. De LED's werden gepulseerd met een snelle MOSFET veld effect transistor. Gelijktijdige opnamen met verschillende indicatoren kan worden uitgevoerd door multiplexen in de tijd de LED's. Helaas, licht uitgezonden door LED's moeilijker zijn om op een vezeloptische vergelijking met een laserbundel. Dus de belangrijkste nadeel van onsing LEDs is dat hun emissie profielen hoekverplaatsingen (± 15 °) van de hoofdas, en een extra optische worden gebruikt om dit te corrigeren.
In alle optische configuraties eerder beschreven, wordt het gereflecteerde excitatielicht met behulp van een dichroïsche spiegel. De bundel wordt vervolgens gefocusseerd door een asferische lens en een microscoopobjectief op een multimode glasvezel die is gepositioneerd op het weefsel. Volgens een epifluorescentie opstelling de dichroïsche spiegel dient ook om de excitatie scheiden van het uitgestraalde licht. Het uitgestraalde licht spectrum reist terug door een barrière filter om eventuele gereflecteerde excitatie verwijderen. Tenslotte wordt het uitgezonden licht zich een objectief op een fotodetector (figuur 1).
De transductie van licht naar elektrische stroom wordt uitgevoerd door silicium avalanche fotodiodes. Deze diodes hebben een snelle reactie en een hoge gevoeligheid waardoor weinig licht detectie. Defotostroom van de avalanche fotodiodes kan worden geamplificeerd in twee manieren: a transimpedantieversterker met een resistief terugkoppelelement (Figuur 1e) of door een integrator om actuele zetten in een spanning (Figuur 1f). Met de eerste benadering, de uitgangsspanning evenredig is met de fotostroom en de terugkoppelweerstand. Een typisch voorbeeld van de resistieve detectie van picoseconde laserpulsen wordt getoond in figuren 2a, 2b en 2c. Panel 2a illustreert de uitgang van de transimpedantieversterker en paneel 2b een tijdexpansie van de met een sterretje (*) interval. Een piekvolgende algoritme toegepast om de piek (rood) en de basis (groen) voor de fluorescente respons 12 te detecteren. De meting van de fluorescentie base bevat informatie van zowel de donkerstroom van de avalanche fotodiode en de storingen die bij omgevingstemperatuur light en elektromagnetische koppeling. Een weergave van pieken en basen is weergegeven in figuur 2c. Deze figuur toont de fluorescentie uitgezonden door de kleurstof (Rhod-2) gebonden aan Ca 2+ tijdens de cardiale cyclus van een kloppend hart parkiet.
In de tweede werkwijze wordt de uitgangsspanning van de integrator is een functie van de huidige en capacitieve terugkoppeling (figuur 2d, 2e en 2f). Figuur 2f toont twee opeenvolgende integratie cycli: de eerste met geen externe verlichting en de tweede met toegepaste lichtpulsen van een pulserende LED. Een gedetailleerde beschrijving wordt gegeven in de figuren 2g en 2h. Deze benadering, hoewel meer bewerkelijke, verschaft een grotere S / N door het ontbreken van thermische ruis in de terugkoppelcondensator. Het instrument bevat een timing stadium dat alle controle- en multiplexing van het excitatielicht genereert en beveelt de headstage integratie en reset perioden. Dit wordt meestal uitgevoerd met een digitale signaalverwerkingsschakeling die ook voert een digitale differentiatie van het geïntegreerde uitgangssignaal door het berekenen van een online regressie van de gegevens. Bij gebruik van een resistieve terugkoppeling, kan elke A / D acquisitie board gebruikt.
Tenslotte maken LFFM techniek is zeer veelzijdig en kan worden aangepast voor het opnemen van meer dan één gebied. Het toevoegen van een bundelsplitser in het lichtpad stelt ons in staat om het licht te splitsen in twee optische vezels. Elke optische vezel kan vervolgens op verschillende gebieden van een weefsel, onafhankelijk wekken en opnemen emissie van de exogene fluorescerende probes worden geplaatst. Deze wijziging stelt ons in om te beoordelen hoe anatomische regionale verschillen beïnvloeden fysiologische variabelen. Figuur 3 toont een bundelsplitser wordt gebruikt voor de CW excitatielicht zodat twee optische vezels worden gebruikt om transmurale elektrische of intracellulaire meten splitsen [Ca 2+] levels with minor-invasief. Transmurale signalen kunnen worden opgenomen door één vezel op het endocardium en de andere aan het epicard laag van de ventriculaire wand. Daarom is de LFFM techniek heeft het vermogen om het tijdsverloop van cellulaire signalen in verschillende regio meten en kan worden gebruikt om te testen of regionale veranderingen optreden onder pathologische omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol en alle muizen handling werd goedgekeurd door de UC Merced Institutional Animal Care en gebruik Comite (No. 2008-201). Experimenten met parkieten werden uitgevoerd in 1999 op basis van de algemene voorwaarden voor het gebruik van dieren vastgesteld door de wetenschappelijke commissie van de Venezolaanse Instituut voor Wetenschappelijk Onderzoek (IVIC).
1. Langendorff Set Up Voorbereiding
- Bereid Tyrode oplossing met de volgende concentraties opgeloste stof in mM: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 glucose, 10 HEPES. De pH van de Tyrode-oplossing op 7,4 met NaOH en filtreer de oplossing door een 0,22 urn filter.
- Laad de Tyrode oplossing in de 60 ml spuiten en alle leidingen van de horizontale Langendorff-up 11, 12 in figuur 4. Zorg ervoor dat alle luchtbellen te verwijderen.
- Sluit de plastic slang aan op een O 2 tank.
- Voeg een plastic stuk adapter aan op een 5 "tube zakken in de Tyrode oplossing in de 60 ml spuit.
- Bevestig een plastic luchtsteen aan het einde van de 5 "buis zodanig O 2 wil bubble uit in de Tyrode-oplossing.
- Plaats een niet-absorbeerbaar chirurgisch hechtmateriaal rond een naald gebruikt als canule. De naald is gekoppeld met het verdeelstuk (zie figuur 4) die retro-perfusie met verschillende oplossingen mogelijk maakt. Tenslotte zal het hart aorta wordt een canule in de naald.
2. Dier Voorbereiding en Hart Dissection
- Weeg en injecteer de muis met heparine (ex. Mouse van het gewicht 20 g, te injecteren met 20 eenheden of 200 pl) 15 min voor euthanasie door cervicale dislocatie. Verdoven parkieten volgens to het gebruik van dieren gebruikershandleidingen van uw IACUC protocol en ga verder met cervicale dislocatie.
OPMERKING: Gebruik 8 weken oude muizen of 20 g parkieten. - Verwijder het hart uit de borstholte na euthanization. Extract parkiet harten op dezelfde wijze als beschreven voor muizen.
- Maak de muis borst met ethanol.
- Gebruik dissectie schaar, een insnijding in de onderbuik en snijd de zijkanten naar de hals.
- Trek de cut weefsel en speld het naar beneden.
- Snijd het middenrif. Wees voorzichtig bij het snijden van het membraan om te voorkomen dat schade aan het hart.
- Verwijder de longen en het omringende weefsel.
- Gebruik een pincet om het hart te scheppen, zonder erin te knijpen. Snijd de aorta zo lang mogelijk.
- Vervoeren het hart op een kleine wegen boot met ongeveer 1 ml Tyrode oplossing.
- Een niet-absorbeerbaar chirurgisch hechtmateriaal, bind de aorta op de horizontale Langendorff apparaat via eennaald. Bind het hart aorta met de hulp van twee fijne pincet. Begin retro-perfusie door openen van de klep in serie met de 60 ml spuiten met Tyrode oplossing.
- Laat het hart stabiliseren 10 minuten. Gebruik deze tijd om bloed en het vetweefsel rond het hart voor het laden van de kleurstof te reinigen. Trek het vetweefsel dichtbij de basis van het hart met een pincet en zaag met kleine dissectie scharen. Zorg ervoor dat u dit te doen onder het oog van een dissectie microscoop.
3. cytosolische Ca 2+ Afmetingen: Het voorbereiden van Dye Rhod-02:00
- Voeg 20 ul van 20% Pluronic (een niet-ionogene oppervlakteactieve stof) in DMSO tot een speciale verpakte plastic buisje van de fabrikant kleurstof bevattende 50 pg van de kleurstof.
- Meng door en neer te pipetteren, het vermijden bellen.
- Breng de gemengde DMSO met niet-ionische surfactant en de kleurstof van de bijzondere verpakte plastic flacon in een heldere glazen flacon. Voeg 1 ml Tyrode solutie aan de heldere glazen flacon.
- Ultrasone trillingen gedurende 15-20 min in een bad ultrasoonapparaat.
- Perfuseren de kleurstof middels peristaltische pompen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de kleurstof in de kleurstof kamer.
- Gebruik een mechanische klem aan alle andere slangen die verbonden zijn met het verdeelstuk comprimeren. De klem boven het spruitstuk geplaatst. Dit voorkomt terugstroming te voorkomen in de slang verbonden met de 60 ml spuiten.
- Schakel de perfusie peristaltische pomp begint circuleert de kleurstof. Sluit direct de 3-wegklep onder de 60 ml spuit.
- Plaats een kleine buis die is verbonden met de zuig peristaltische pomp naast het hart om de kleurstof die is geperfundeerd in het hart recirculeren.
4. Intra-SR Ca 2+ Afmetingen: Het voorbereiden van Dye Mag-Fluo4AM
- Bereid Mag-Fluo4AM op dezelfde wijze als Rhod-02:00. Zie sectie 3 voor stapsgewijze instructies.
- after het laden van de kleurstof, opent de klep in serie met de 60 ml spuiten met Tyrode oplossing voor retro-perfusie beginnen. Zorg ervoor dat de klem te verwijderen boven het spruitstuk.
- Voeg Tyrode oplossing voor de horizontale trek en opwarmen tot 37 ° C.
- Retro-perfuseren met Tyrode oplossing gedurende 45 minuten aan de cytosolische kleurstof te verwijderen.
5. Membraan Potentiële Metingen: Het voorbereiden van Dye Di-8-ANEPPS
- Voeg 5 ml 99% ethanol om de kleurstof flacon die 5 mg van de kleurstof bevat.
- Aliquot 10 pi in 500 individuele 1 ml plastic flacons met behulp van een repeater pipet.
- Drogen in een vacuüm snelheid en bewaar bij -20 ° C.
- Voeg 20 ul van 20% Pluronic in DMSO tot een plastic flesje met 10 ug van het gedroogde kleurstof.
- Meng door en neer te pipetteren, het vermijden bellen.
- Breng het mengsel dat met DMSO en Pluronic kleurstof uit de plastic flacon naar een maatcilinder (10 ml). Voeg Tyrode oplossing tot een uiteindelijke volume van 5 ml.
- Ultrasone trillingen gedurende 20-25 min in een bad ultrasoonapparaat.
- Perfuseren naar het hart gedurende 30 min met behulp van peristaltische pompen. Raadpleeg de stapsgewijze instructies in paragraaf 3.5.
6. Opnemen Epicardiale Signalen
- Na het laden van de kleurstof, retro-perfuseren het hart met Tyrode oplossing door het verwijderen van de klem boven het spruitstuk. Open de klep in serie met de 60 ml spuit met Tyrode oplossing. Retro-perfuseren Tyrode oplossing gedurende 10 minuten naar het hart te stabiliseren.
- Vul het horizontale trek met Tyrode oplossing en zet de Peltier unit de badtemperatuur tot 37 ° C te brengen.
- Plaats de glasvezel op het oppervlak van het hart.
- Leg de glasvezelkabel in een 2 mL pipet en bevestig vervolgens de pipet naar een micromanipulator.
- Gebruik de micromanipulator enigszins op de glasvezel tegen het oppervlak van de LV.
- Extern tempo de heart met een stimulator bestuurd door een golf generator.
- Programmeer de golfgenerator een blokgolf te voorzien van een breedte van 1 ms.
- Stel de stimulator extern worden gesynchroniseerd en sluit de externe ingang naar de wave generator.
- Elke uitgang van de stimulator, sluit een draad met een acupunctuurnaald gesoldeerd aan het einde.
- Plaats beide acupunctuurnaalden in de apex van het hart ongeveer 3 mm van elkaar.
- Pas nadat de naalden in het weefsel plaatst, zet de uitgang van de stimulator elektrische schokken.
- In de acquisitie software, passen overname frequentie tot 10 kHz.
7. Opnemen Endocardiale Signalen
- Zie stap 6,1 en 6,2 om het hart te stabiliseren na het laden van de kleurstof.
- Met behulp van een scherpe 23Ga punt over de grootte van de glasvezel, maak een klein gaatje in het oppervlak van het hart in de LV in de buurt van het septum. <li> Plaats een intravitreale operatie sclerotomie adapter om te helpen bij het positioneren van de eerste optische vezel in het endocardium met behulp van een micromanipulator.
- Extern tempo het hart. Zie stap 6.4.
- In acquisitie software, passen overname frequentie tot 10 kHz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AP en Ca 2+ transiënten in endocardium en epicard
Om signalen te vergelijken in de kamerwand, is een vezeloptische gepositioneerd in het endocardium en de andere in het epicard. Vergelijking van de morfologie van een AP vastgelegd vanaf het endocardium met één van de epicard is de beste manier om de transmurale functie beoordelen. De kamerwand is heterogeen en dus de morfologie van de AP's zijn zeer verschillend in deze twee gebieden. Het is bekend dat het endocardium minder dan I bij het epicardium 17, 18, 19. Hoe minder I maakt de repolarisatie van fase 1 langzamer in het endocardium 18, 20. Figuur 5b shows een typische optische registratie van de AP van het endocard en epicard. Om deze opnamen te voeren, werden muizen harten geladen met de potentiometrische kleurstof di-8-ANEPPS en fluorescentie werd gemeten met de CLFFM techniek. De morfologie van de optisch opgenomen AP, met name in fase 1 toont een langzamer tijdsverloop voor het endocardium (actiepotentiaalduur (APD) 30 is 8,01 mg ± 2,5) ten opzichte epicard (3,4 mm ± 0,59) (Figuur 5b). In het algemeen kan de APD worden omschreven als de tijd die het kost de AP om een bepaald percentage met 30, 70 of 90 (figuur 5a) repolarize. Deze sporen zijn genormaliseerd en worden omgezet in overlappende fase 0. hebben Bij vergelijking van de APD (figuur 5c), zien we dat het endocard en epicard zijn significant verschillend in fase 1. Hoewel deze APs fluorescentiesignalen zijn, ze kunnen afstemmen op specifieke membraanpotentiaal door tegelijkertijd de AP meten met eenscherpe micro-elektrode gevuld met 3 M KCl 13.
Naast potentieel membraan, kunnen exogene fluorescente indicatoren worden gebruikt om de intracellulaire [Ca2 +] volgen. Meestal gebruiken we Rhod-02:00 intracellulaire Ca 2+ transiënten vanwege zijn hoog dynamisch bereik en de mogelijkheid om te verblijven in het cytoplasma, zelfs bij fysiologische temperaturen te meten. Figuur 6b toont een typische opname van de intracellulaire Ca2 + transiënten in het endocard en epicard laag. Deze resultaten zijn gedeeltelijk gepubliceerd 15. Om de regionale verschillen in de intracellulaire vergelijken [Ca2 +] niveaus, de kinetiek van de Ca2 + transiënten werden bepaald (figuur 6a). Kortom, de analyse van de Ca2 + voorbijgaande kinetiek (Figuur 6c) laat zien dat de Ca2 + transiënten van het endocardium had significant langzamere kinetiek dan opgenomen vanaf het epicard.
Ca2 + dynamiek in de SR lumen
In het hart, de opkomst en ondergang van de intracellulaire [Ca 2+] niveaus zijn van cruciaal belang bij het bepalen van een groot aantal fysiologische variabelen zoals druk, contractiliteit en actiepotentiaal duur (APD). In de vorige paragraaf beschreven ons vermogen om de cytosolische Ca 2 + transiënten meten. De Ca 2+ vrijgelaten uit de SR is grotendeels verantwoordelijk voor de stijging van intracellulaire cytosolische Ca2 +. Dus voor elke toename van de intracellulaire Ca2 + is een Ca2 + depletie in de SR. Echter, cytosolische Ca 2 + transiënten zijn niet uitsluitend te wijten aan SR Ca 2 + release, maar ook Ca 2+ in de cel die door de plasmamembraan. onze lab16 heeft kunnen de SR Ca 2+ gehalte in het gebruik van een fluorescente kleurstof, Fluo-Mag-04:00 evalueren. Hoewel deze kleurstof is de-veresterd in de myoplasm en de SR, kan de myocyten extruderen uit de cytosolische fractie. Deze kleurstof extrusie kan worden bevorderd door eenvoudig de temperatuur verhoogd tot 37 ° C. Bij deze temperatuur wordt de cytosolische matrijs verwijderd door een ATP-bindende cassette als membraaneiwit. Gelukkig is dit eiwit niet in het SR membraan. Daarom na het verhogen van de temperatuur tot 37 ° C, de fluorescentie opgenomen met de PLFFM techniek is grotendeels een gevolg van de Ca2 + binding aan de kleurstof in de SR. Met het oog op de specificiteit van het organel meting te testen, werd een cafeïne puls toegepast op Ca 2+ vrijlating stimuleren door RyR. Het is mogelijk om te zien dat het signaal inderdaad een gevolg van de uitputting SR (Figuur 7). De cafeïne geïnduceerde SR Ca 2+ vrijkomen (figuur 7a) Produceert zowel een afname in diastolische niveau van Mag-Fluo-4 fluorescentie (92 ± 0,05% (N = 4, p = 0,012)) en een afname van de amplitude van Ca2 + transiënten (51 ± 0,21% (N = 4, p = 0,003)) 16. Intra SR sporen geregistreerd voor en na de stimulus cafeïne vertegenwoordigd neerwaarts in figuur 7b-7d. Naarmate de tijd vordert van de cafeïne stimulus, amplitude van de SR uitputting kleiner. Figuur 7e illustreert dat SR depletie niet alleen leidt tot een afname van de amplitude van de Ca2 + signaal, maar vertraagt ook de SR Ca 2 + releaseproces. De fluorescentie spoor in figuur 7a is eerder gepubliceerd 15.
Pulsed LED: Actiepotentialen
In figuur 5 toonden wij aan dat Di-8-ANEPPS veranderingen kunnen meldenin de membraanpotentiaal als het geëxciteerd bij 532 nm. Onder deze excitatie toestand, er een afname van de fluorescentie uitgestraald op golflengten groter dan 590 nm. Interessant, wanneer deze potentiometrische kleurstof geëxciteerd dichtbij de maximale excitatiegolflengte (~ 476 nm), de fluorescentie-emissie van de kleurstof verschuift naar lagere golflengten als de membraan depolariseert. Derhalve spectrale verschuiving stelt ons in de geëmitteerde fluorescentie opnemen op twee verschillende golflengten. Deze spectrale eigenschap van di-8-ANEPPS maakt het toevoerwiel van de uitgestraalde fluorescentie opgenomen op twee verschillende golflengten, een functie die meestal van groot belang omdat de uiteindelijke berekende opname onafhankelijk van de kleurstof concentratie in het membraan zullen zijn. Om optimaal te profiteren van de Di-8-ANEPPS spectrale shift, gebruikten we gepulste LED's als lichtbron. We gebruikten gepulseerd blauw licht om de fluorofoor te wekken. Excitatie werd uitgevoerd bij 485 nm, dicht bij de piek absorptiegolflengte van Di-8-ANEPPS (~ 476 nm). Acquisitie in twee verschillende emissie spectroscopische bands maakt vorming verhouding en de mogelijkheid om S / N te verhogen en common mode ruis, zoals milieu-licht en beweging artefact verwerpen aanbestedende harten waar de mechanische ontkoppelrail blebbistatin niet is gebruikt. Deze situatie is zeer belangrijk voor experimentele omstandigheden waarbij zowel de mechanische activiteit van het hart en de kinetiek van Ca2 + transiënten moeten gelijktijdig worden gemeten.
Timingdiagram van de PLEDFM wordt geïllustreerd in figuur 8a. Het schema omvat de besturingslogica voor de integratie en reset van de fotodetectie headstage, de aan-uit timing van de LED en de analoog-naar-digitaal omzetting. Gedurende het tijdsverloop van een AP, het gedetecteerd in de groene golflengteband fluorescentie toont een verhoging van de tijdens het gedetecteerd in het rode fluorescentie band afneemt. Figuur 8b toontdat de verandering van het fluorescentiesignaal door het membraan depolarisatie beweegt in verschillende richtingen. Echter, de bewegingsartefacten door het hart contractie altijd georiënteerd in dezelfde richting, onafhankelijk van de emissiegolflengte. Zoals eerder uitgelegd, moeten de gegevens van beide kanalen (groen en rood)-software voorziene vóór de berekening van de verhouding. De conditionering omvat offset en krijgen correcties. De selectie van offset en gain niveau correcties is niet automatisch. De gebruiker van de software de variabelen selecteren om de sporen staat voor de verhouding. De resulterende verhouding in panel 8b (figuur 8) toont dat de artefact geïntroduceerd door de myocardiale beweging geannuleerd.
De relatieve verandering van di-8-ANEPPS fluorescentie tijdens een AP is meestal zeer klein (~ 8% per 100 mV). Deze di-8-ANEPPS fluorescentieverandering is veel kleiner dan die geproduceerd door de Ca2 + binding tot Rhod-2 (<200%). Aldus teneinde de signaal-ruisverhouding van di-8-ANEPPS verhogen, verschillende opnamen kunnen worden gemiddeld.
Pulsed LED: Gelijktijdige opnames van Ca 2+ en membraanpotentiaal
Het laatste doelpunt met behulp van deze experimentele benadering bestaat uit het uitvoeren van simultane opnames van Ca 2+ transiënten en AP. Gelijktijdige opnamen van verschillende fysiologische signalen vereisen lossen technische problemen in verband met verschillende aspecten van het systeem, inclusief: het koppelen van de lichtbron met optische vezel, de absorptie- spectrum van de kleurstof met de emissie van de LED's, het ontwerpen van de analoge en digitale elektronische schakeling genereren van de timing en verkrijging en de snelle ontwikkeling van software te analyseren online.
in our studie, de keuze van kleurstoffen afhankelijk van hun spectrale eigenschappen. Flourophores gebruikt om verschillende signalen te meten moeten opnemen in verschillende spectrale banden. Deze voorwaarde is noodzakelijk onderscheid te maken tussen signaalbronnen. Elke keer dat een LED met een andere golflengte wordt gebruikt om het weefsel te exciteren, de gedetecteerde fluorescentie overeenkomt met het signaal gerelateerd aan de kleurstof die absorbeert bij die golflengte. Zo fluorescentie-emissie afkomstig van verschillende kleurstoffen, maar in dezelfde golflengteband, kunnen worden onderscheiden door het tijdstip waarop elk is opgewonden.
Toch is de overspraak tussen kleurstof spectra niet volledig vermeden. Dit komt omdat de spectrale absorptie-eigenschappen van de kleurstoffen ze licht absorberen met een golflengte ver van hun piekabsorptie. In onze experimenten werd overspraak geproduceerd in twee manieren: (1) Rhod-2 wordt opgewekt door de blauwe LED, het toevoegen van een Ca2 + signaal naar de rode Channel AP trace, en (2) di-8-ANEPPS wordt opgewekt door de groene LED, die de Ca2 + voorbijgaande signaal (figuur 9f) weergegeven. Deze overspraak kan worden gecorrigeerd on-line, zoals weergegeven in figuur 9. De procedure werkt omdat het storend signaal een klein percentage van het signaal dat moet worden gemeten. Bovendien zullen, met dit type algebraïsche bewerking van de fluorecence van de kleurstoffen lieten AP (figuur 9d) geïsoleerde vormen Ca2 + transiënten (figuur 9H). Een gedetailleerd overzicht van deze verwerking wordt beschreven in de legenda van de figuur. Het is belangrijk op te merken dat alle Pulsed LED experimenten werden een 28 ° C.
Figuur 1: Lokale Field fluorescentiemicroscopie (LFFM). De LFFM bestaat uit een epifluorescentie arrangementmet een multimode optische vezel die in contact met het weefsel om de fluorescentie geëmitteerd door exogene kleurstoffen geperfundeerd in het hart te nemen. LFFM de set-up kan gebruiken drie verschillende lichtbronnen waaronder (a) PLFFM, wanneer excitatielicht wordt geleverd door een gepulseerde pico Nd-Yag laser; (B) CLFFM, waarbij continue golf lasers worden gebruikt en lichtpulsen worden gegenereerd door een ferroelektrische modulator waardoor de multiplexing van lasers met verschillende golflengten; en (c) PLEDFM, waarbij LEDs met bredere emissie spectrum met een piek emissie van (d), 485 nm en 540 nm voor blauwe en groene LEDs respectievelijk elektronisch gepulst. Wanneer laserbronnen worden gebruikt, wordt de bundel gedefocusseerd een bundel expander. Tenslotte dichroïsche spiegels en objectieven focus van de bundel op het distale uiteinde van de vezeloptische's die enigszins tegen het weefsel gedrukt. Het uitgestraalde licht reist terug door dezelfde glasvezel, dichroïsche spiegel, emission filters, en wordt gefocusseerd op een lawine fotodiode waarbij fotonen worden omgezet in een elektrische stroom. De stroom kan worden geamplificeerd door twee methoden (e) transimpedantieversterker, waarbij de resulterende uitgangsspanning evenredig is met de fotostroom en de terugkoppelweerstand; (F) integrator, waarbij de uitgangsspanning is een functie van de huidige en capacitieve terugkoppeling. Tenslotte wordt het signaal verkregen door een A / D-omzetter en op een computer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Resistive en capacitieve Conversion. (A) Een typisch voorbeeld van de resistieve detectie van picoseconde laserpulsen weergegeven. De asterisk (b)een tijdsdiagram geëxpandeerde interval, indien een piekvolgende algoritme werd toegepast om de piek (rood) en de basis (groen) te detecteren. (C) een representatie van sporen berekend uit pieken en basen opnamen getoond voor Rhod-2 fluorescentie respons in een kloppend hart parkiet extern gestimuleerd met 7 Hz en badtemperatuur ingesteld op 37 ° C. d tot h) De fotostroom omgezet door een integrator met een capacitieve terugkoppeling. Typische opname van intacte muizenhart Ca2 + transiënten wordt in twee verschillende tijdschalen (d en e). (F) De integratie van de twee opeenvolgende cycli met en zonder LED-verlichting worden weergegeven. De integraal van het signaal lineair toeneemt als fotostroom laadt de terugkoppelcondensator. De helling van de tijdsafhankelijke integrale (tan (Ɵ)) evenredig is met het aantal fotonen beïnvloeden de lawine splitsing naast de elektron-gat recombinatie geïnduceerd door de phononic activiteit wanneer de lawinediode geen fotonen detecteren. De digitale signalen besturen van headstage integratie en reset periodes worden in panel g. Signalen gedetecteerd tijdens de niet-lichtdoorlatende (DC) en LED lichtdoorlatende periode (F) getoond in panel h. Het aftrekken van F en DC geeft de feitelijke meting van fluorescentie gedetecteerd Ca2 + transiënten van muizen harten extern gestimuleerd met 9 Hz bij 37 ° C (h). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: LFFM voor Epicardium en Endocard Metingen. De CLFFM opstelling werd gebruikt om de fluorescentie geëmitteerd door exogene fluorescerende kleurstoffen in de epicardium een meetd endocardium lagen. De toevoeging van een bundelsplitser vergemakkelijkt de opname van verschillende fysiologische variabelen in het epicardium en endocardium. Twee glasvezel gebruikt met hun individuele headstages maakt uit het epicardium en endocardium. Een kleine cirkelvormige incisie werd gemaakt in het ventrikel en een glasvezelkabel werd schroefdraad door te nemen van het endocardium. Deze set-up gebruikt een stroom-naar-spanning-omzetter met een resistieve feedback. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Horizontale kamer met temperatuurregeling. Een diagram dat de Langendorff set-up, waar intact harten functioneel voor de uren worden gehandhaafd. Het hart is gebonden aan een naald waardoor alle oplossingen en pigmentenzijn retro-doorbloed naar het hart via de kransslagaders vertakking van de aorta. De kamer wordt boven een Peltier unit geplaatst om de temperatuur van het bad, dat wordt gelezen door een temperatuursensor verbonden met een voltmeter handhaven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Transmurale Action Potential Metingen in Intact Harten. (A) actiepotentiaalduur (APD) wordt bepaald als de tijd die nodig is om 30%, 70% of 90% van het AP repolarisatie voltooien. (B) di-8-ANEPPS fluorescentie van het epicard (zwart) en endocardium (grijs) tonen AP morfologische verschillen in repolarisatie tussen de twee lagen van de ventriculaire wand. (C) Na beoordeling thij 30, 70, en 90 in het endocard en epicard APD, resultaten toonden enige significante verschillen opgetreden in APD 30 (8 ± 2,5 ms endocardium vs 3 ± 0,6 ms epicard). Harten werden gestimuleerd met 6 Hz en de temperatuur ingesteld op 37 ° C. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM van 5 hart. * P <0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Transmurale Ca 2+ Transient Metingen in Intact Harten. (A) Parameters van Ca2 + voorbijgaande kinetiek gemeten zijn: de tijd die nodig is om maximale bereiken, tijd tot piek (TP); de tijd die nodig is om van 10% tot 90% van de stijging, stijgtijd (RT); de tijd die nodig is om van 10% tot 90% van het verval, afvaltijd (DT); en detijd die nodig is om 50% van het vluchtige, halve tijdsduur (HD) te voltooien. (B) Fluorescentie uitgezonden door Rhod 2 na excitatie met een groene CW-laser show epicard (zwart) en endocardium (grijs) Ca 2+ transiënten met verschillen in ontspanning. c) Ca 2+ transiënten van het endocard had beduidend langzamer kinetiek in RT, TP, HD, en DT dan opgenomen vanaf het epicard. Harten werden gestimuleerd met 6 Hz en de temperatuur ingesteld op 37 ° C. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM van 5 hart. * P <0,05. Gewijzigd ten opzichte van Mattiazzi et al. 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Intra SR Ca 2+ Metingen in Intact Harten.(A) de geëmitteerde fluorescentie van de Mag-Fluo-4 kleurstof loop der tijd afneemt als gevolg van een afname van de intra SR Ca2 + -concentratie. (B) is de inhoud van de afname van Mag-Fluo 4 fluorescentie aangeeft Ca 2+ depletie geïnduceerd door Ca2 + afgifte uit de SR. (C) Een uitgebreide weergave van de daling van de voorbijgaande amplitude van Mag-Fluo 4 fluorescentie vertegenwoordigt Ca 2+ vrijlating gewijzigd door perfuseren harten met 20 mM cafeïne. (D) Na een toepassing van cafeïne, een afname van zowel de diastolische niveau van Mag-Fluo-4 fluorescentie en de amplitude van Ca2 + transiënten [naar 92 ± 0,05% (N = 4, p = 0,012) en 51 ± 0,21% (N = 4, p = 0,003) van de basiswaarden respectievelijk], waargenomen. Naarmate er meer tijd vordert van cafeïne, hoe geringer de amplitude van de SR uitputting. (E) De genormaliseerde sporen in bd toont aan dat SR uitputting niet alleen te inducerens vermindert van het Ca 2+ signaal, maar vertraagt ook SR Ca 2+ aanvulling. Harten werden gestimuleerd met 4 Hz en de temperatuur ingesteld op 37 ° C. Fluorescentie trace is vanaf Kornyeyev et al. 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Ratiometrische Metingen van AP in Intact harten met Pulsed LED. (A) Het tijdbepalingsdiagram inclusief integratie en reset van de headstage op tijd van de LED en een feitelijke opname geïllustreerd. (B) Sporen uit de twee kanalen verschillende waarden rusten en de offset wordt gecorrigeerd door het bewegen van de hefbomen totdat elk AP wordt voorafgegaan door een rustwaarde. Winst van elk kanaal is ook de rted. Merk op dat een zeer grote beweging artefact wordt op beide kanalen tussen de twee depolarisaties. Nadat de software verwerkt de signalen ratiometrically, het resultaat is een AP zonder merkbare artefacten (blauw). Harten werden gestimuleerd met 3 Hz en de temperatuur ingesteld op 28 ° C. Alle getoonde gegevens zijn een gemiddelde van 10 sporen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Gelijktijdige Ca 2 + transiënten en AP Metingen in Intact Harten met Pulsed LED. De overspraak besmetting van de signalen bij het opnemen van zowel Ca 2+ en AP gecorrigeerd kunnen worden on-line. De potentiometrische kleurstof, di-8-ANEPPS, wordt geëxciteerd met 20 microseconden blauwe LED pulsen (a). Signalen sPlit, gefilterd met bandpass rode en groene filters. Deze signalen worden gedetecteerd door twee verschillende avalanche fotodiodes aangeduid als de rode (b) en groene kanaal (c). Het is mogelijk om te zien dat beide signalen, rood en groen, vormen een duidelijke wijzigingen artefact dat wordt weergegeven als een neerwaartse afbuiging. Beide signalen, rood en groen, worden offseted en vervolgens geamplificeerd. De geconditioneerde signalen worden gebruikt om de verhouding te berekenen en het resultaat wordt getoond in d. Het is mogelijk om te zien dat de verhouding tussen beide signalen (d) de bewegende voorwerpen worden geannuleerd. Panel e illustreert de opeenvolging van de logica pulsen die bepalen een groene emitterende LED gebruikt om de Ca 2+ indicator Rhod-2 prikkelen. Fluorescentiesignalen verkregen middels deze werkwijze zijn weergegeven in f. Hoewel het spoor in F toont meestal een verhoging van het fluorescentiesignaal als gevolg van de Ca2 + binding tot Rhod-2, is ook een negatieve deflectie in het spoor waarnemen door een fluorescent gedetecteerde signaal uit di-8-ANEPPS wanneer deze kleurstof wordt geëxciteerd met groen licht. Dit probleem kan worden gecorrigeerd door het aftrekken van de potentiometrische signaal getoond in g. Het resultaat van de aftrekking wordt getoond in paneel h wanneer een Ca2 + signaal zonder een AP verontreiniging wordt verkregen. Harten werden gestimuleerd met 3 Hz en de temperatuur ingesteld op 28 ° C. Alle getoonde gegevens zijn een gemiddelde van 10 sporen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit papier is gecentreerd beschrijven lokale gebied fluorescentie technieken om de functie van cardiale myocyten ex vivo te evalueren. Het onderzoek van deze cellen in een gekoppelde omgeving is niet alleen fysiologische, maar is ook zeer geschikt voor het beoordelen orgaan niveau pathologieën. De onderliggende cellulaire gebeurtenissen excitatie-contractie koppeling (ECC) kan worden vastgesteld op het gehele orgel niveau met behulp van moleculaire probes die intracellulaire Ca2 + dynamiek monitor (Rhod 2 cytosolisch Ca2 +, Mag-Fluo4 SR Ca 2+) en elektrische activiteit (di-8-ANEPPS). Hier hebben we voorgesteld drie LFFM epifluorescentie technieken die zowel prikkelen en het verzamelen van de uitstoot van TL-indicatoren met behulp van optische vezels. Ze verschillen op basis van de gebruikte lichtbron en de aard van het licht modulatie. De PLFFM maakt gebruik van een laser die pulsen licht, CLFFM maakt gebruik van continue laserlicht, terwijl LEDFM maakt gebruik van LED's die ook kan worden gepulseerd in de PLEDFM. Al dezezijn weergegeven in Figuur 1 als één set, maar kan worden uitgevoerd met slechts één van de drie epifluorescentie wijze. Bovendien kan het gedetecteerde licht wordt verwerkt op verschillende wijzen. Bijvoorbeeld, figuur 2 illustreert twee situaties waarin de fotostroom geïntegreerde of rechtstreeks omgezet in een spanning door middel van een stroom-spanningsomzetter kan worden. In het algemeen kan de LFFM benadering worden gebruikt voor het gelijktijdig meten van meerdere anatomische plaatsen, zoals gezien figuur 3.
De hier gepresenteerde methode voor het beoordelen van cardiale eigenschappen op het intacte orgaan niveau adequater problemen waarbij de koppeling tussen cellen is cruciaal bij het bepalen van het gedrag van het weefsel te bestuderen. De intrinsieke heterogeniteit van het hart kan verschillende AP produceren golfvormen 13, 21, 22 gebaseerd op het specifieke weefsel waaruit ceLLS ontstaan. Derhalve geheel orgaan studies bieden de mogelijkheid om de lokale fysiologische functie van de cel in verschillende anatomische structuren beoordelen. Bovendien hebben we gezien dat intracellulaire evenementen zoals vonken en golven hebben verschillende kinetiek in gescheiden cellen dan in het intacte orgaan 15.
De Langendorff set-up (figuur 4) is van cruciaal belang voor het behoud van het hart in een situatie die dichter bij in vivo. Bovendien, kan de retroperfusiesysteem meerdere geneesmiddelen en diverse fluorescerende moleculaire probes die het meten van een aantal fysiologische variabelen mogelijk. Veranderen van de exogene fluorescerende probes gebruikt, verhogen van de grootte van de vezeloptische of Selecteer een lichtbron kan drastisch veranderen de toepassing van de techniek. Bovendien kan de Peltier eenheid onder de horizontale trek de studie Ca2 + dynamiek bij verschillende temperaturen te vergemakkelijken. het toevoegen van accessoiresom zo'n LFFM als een bundelsplitser het aantal optische vezels worden gebruikt om op te nemen uit verschillende regio's in het intacte hart kan verhogen. Dit is een zeer nuttige aanpassing te testen of regionale verschillen voorkomen in pathologische scenario. Figuur 3 toont het endocard en epicard gelijktijdig onderzocht. Bovendien perfuseren het hart met verschillende agonisten stelt ons in staat om te begrijpen hoe de verschillende regio's in de ventriculaire wand worden geregeld. Het elektrische signaal (figuur 5) en Ca2 + kinetische (figuur 6) heterogeniteiten kunnen worden vergeleken in het epicardium en endocardium. Bovendien kunnen meerdere kleurstoffen met verschillende golflengten en emissie filters gebruikt. Bijvoorbeeld door Mag-Fluo-4, Ca2 + niveaus in het lumen van de SR kan worden opgenomen (figuur 7). Variëren van de grootte van de glasvezel kan ook het vermogen van deze methode uitbreiden doordat de fluorescerende opname van een larregio ger.
Dit document toont tevens dat afgezien van dure lasers, LED's kan worden gebruikt als een excitatie lichtbron onze techniek. Figuur 8 toont dat deze goedkope type lichtbron kan worden gebruikt om ratiometrically meten APs. De ratiometrische meting figuur 8 is voordelig produceren van een uiteindelijke opname zonder experimentele artefacten waaronder die veroorzaakt door beweging. Tenslotte kan ook de Ca2 + voorbijgaande en AP optisch geregistreerd, gelijktijdig door multiplexing verschillende golflengten en gebruiken kleurstoffen met dezelfde emissiespectra. De verwerking van signalen geschetst in figuur 9 is cruciaal verwijderen van inwendige besmetting door de overlap in emissiespectra van de kleurstoffen. Opname Ca2 + transiënten en AP, tegelijkertijd, maar als twee onafhankelijke uitgangssignalen gunstig bestuderen ECC en Ca2 + geïnduceerde Ca 2+
LFFM is een techniek met meerdere aanvragen cellulaire fysiologie van intacte weefsels. Echter, een belangrijke beperking is dat de opgenomen fluorescentie is een gemiddelde van de emissie van de onderliggende fluorescente indicatoren in de streek waar de optische vezel in contact met het weefsel. Zelfs bij gebruik van twee optische vezels, is geen LFFM een subcellulaire ruimtelijke verdeling van de gemeten signalen. Optische mapping is een betere techniek voor het bewaken van fysiologische grootheden die in ruimte en tijd, zoals de voortplanting van de AP, Ca2 + transiënten en alternantie 23, 24, 25. LFFM is ook niet in staat om beeldvorming van structuren, zoals confocale microscopie en andere optische mapping technieken. Toch is het gebruik van glasvezel maakt het praktisch in rOpnam lokale fluorescentie signalen van de endocardium of andere gebieden die moeilijk of onmogelijk zijn om toegang te krijgen in een intacte hart met een confocale microscoop.
De vergelijking tussen fysiologische variabelen verkregen uit intacte harten en van geïsoleerde myocyten experimenten is een uitdaging. Het grootste voordeel van het gebruik van geïsoleerde hartspiercellen is de unieke kans om biofysische eigenschappen van de cellen onder patch clamp te evalueren. Daarentegen LFFM maakt het onderzoek mogelijk van de fysiologische en pathologische verschijnsel in een natuurlijke omgeving. Bijvoorbeeld, in intacte harten zijn de transmurale verschillen 15, hartslag afhankelijkheid van AP en Ca2 + bij fysiologische bereik 13 die onbereikbaar in geïsoleerde cellen te beoordelen. Daarnaast kunnen de effecten van een ischemisch insult op de functie van het intacte hart 9, 10 bestuderen. Ganse hart experiments ook ons in staat stellen om de interactie tussen andere celtypen en myocyten 11 te evalueren.
LFFM maakt de visualisatie van cellulaire signalen in het intacte hart niveau waarbij cellen fysiologische koppeling. LFFM maakt het onderzoek mogelijk van intracellulaire activiteit terwijl cellen nog in het intacte orgaan. Ca 2+ dynamiek en elektrische activiteit: In combinatie met fluorescerende kleurstoffen en epiluminescence, kan LFFM twee belangrijke cardiale eigenschappen controleren.
Tenslotte kan de werkwijze hier gepresenteerde meerdere applicaties in de studie van ECC hebben. Het is een tool die laat zien hoe supramoleculaire signalen worden beïnvloed in pathologische situaties, zoals hartritmestoornissen 16 en ischemie 9, 15. Deze techniek is een must om deze pathologieën te bestuderen, omdat ze alleen kunnen worden begrepen op het intact orgel niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Alicia Mattiazzi voor kritische bespreking van het gepresenteerde werk. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH (R01 HL-084487) aan ALE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
- Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
- Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
- Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
- Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
- Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
- Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
- Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
- Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
- Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
- Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
- Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
- Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
- Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
- Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
- Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
- Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
- Antzelevitch, C., Fish, J.
- Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
- Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R.
- Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).
