Summary
سوف قابلة الأوعية الدموية المهندسة تحسين تطبيق السريرية. باستخدام أدلة كبيرة بسهولة مطبوعة 3D، تم إنشاء حلقات من العضلات الملساء الوعائية ومكدسة في شكل أنبوبي، وتشكيل الكسب غير المشروع الأوعية الدموية. يمكن أن يكون الحجم ترقيع لتلبية مجموعة من الأبعاد الشريان التاجي الإنسان ببساطة عن طريق تغيير حجم دليل مطبوعة 3D.
Abstract
لا يزال مرض الشريان التاجي السبب الرئيسي للوفاة، مما يؤثر على الملايين من الأميركيين. مع عدم وجود ترقيع الأوعية الدموية ذاتي المتاحة، وتوفر الطعوم المهندسة إمكانات كبيرة لعلاج المرضى. ومع ذلك، ترقيع الأوعية الدموية المهندسة هي عموما ليست قابلة بسهولة، الأمر الذي يتطلب تصنيع قوالب مخصصة أو أنابيب البوليمر من أجل تخصيص لأحجام مختلفة، مما يشكل ممارسة تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. وتتراوح الشرايين الإنسان في قطر التجويف من حوالي 2،0 حتي 38 مم وسمك الجدار من حوالي 0،5-2،5 مم. لقد أنشأنا طريقة، يسمى "حزام زرع الطريقة"، والذي حلقات حجم مختلفة من الأنسجة من نوع الخلية المطلوبة، تظاهر هنا مع خلايا العضلات الملساء الوعائية (SMCS)، ويمكن إنشاؤها باستخدام أدلة من المشاركات مركز للسيطرة قطر التجويف والأغلفة الخارجية لإملاء سفينة سمك الجدار. ثم يتم تجميع هذه الحلقات الأنسجة لإنشاء بناء أنبوبي، ومحاكاة شكل طبيعي في أحد الاوعية الدموية. ويبلغ طول السفينة يمكن بالبريد مصممة ببساطة عن طريق تكديس عدد من حلقات المطلوبة لتشكل طول المطلوبة. مع تقنية لدينا، الأنسجة من أشكال أنبوبية، على غرار أحد الأوعية الدموية، ويمكن تصنيعها بسهولة في مجموعة متنوعة من أبعاد وأطوال لتلبية احتياجات العيادة والمريض.
Introduction
في علاج أمراض الشريان التاجي (CAD)، ويتم حصاد الأوعية الدموية من المريض نفسه كمادة الكسب غير المشروع لعملية جراحية. ومع ذلك، في كثير من الأحيان، والمرضى المصابين بأمراض لا تملك السفن قابلة للحياة للتبرع لأنفسهم، وفي الحالات التي لم يفعلوا، وموقع المانحة يسبب ضرر إضافي كبير ولديه خطر جدي للعدوى. 1 ترقيع الأوعية الدموية المهندسة يمكن أن تسد هذه الحاجة. التدرجية هو من أهمية قصوى بالنسبة للسفن الهندسة من أجل تلبية مجموعة واسعة من متطلبات المريض حجم السفينة. ومع ذلك، الأساليب الحالية للسفن الهندسة ليست بسهولة قابلة لل، وعادة ما تتطلب إعادة تصنيعها من قوالب معقدة أو السقالات البوليمر. الأكثر المهندسة الطعوم إما الاستفادة سقالة البوليمر أنبوبي الذي المصنف مع الخلايا الليفية الوعائية، العضلات الملساء، أو الخلايا البطانية. أو المتداول ورقة خلية حول مغزل لإنشاء أنبوب الأنسجة. تستند اثنين ترقيع الأوعية الدموية المهندسة في التجارب السريرية على decellularizeد منصة البوليمر ECM. 2، 3، 4 ترقيع بوليمر المتاحة للاستخدام في إصلاح الأوعية الدموية معروفة لديك مشاكل مع المباح، والتي يمكن أن تنشأ باعتبارها قضية رئيسية مع تطبيق على المدى الطويل من الكسب غير المشروع مع وجود البوليمر المستدام. وقد استخدمت قوالب أنبوبية لتصنيع أوعية تماما الخلوية، 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11، 12، 13 التي الإجراءات يتطلب تصميم إضافي وتصنيع أداة لقوالب مخصصة لإنتاج السفن في مجموعة متنوعة من الأحجام .
الطريقة الموصوفة هنا يشمل تقنية جديدة لخلق الأوعية الدموية المهندسة تحجيم بسهولةترقيع باستخدام تخصيص 3D إدراج المطبوعة ولوحات الثقافة التقليدية. هي المصنفة 14 خلايا في لوحات مع تدرج من وظيفة المركزية والغلاف الخارجي. الضوابط آخر التجويف قطر، وتتيح للأحادي الطبقة خلية في تقرير المصير، التجمع في حلقة من الأنسجة. والخارجي ضوابط قذيفة سماكة من الحلبة، وبالتالي سماكة جدار السفينة النهائية. ثم يتم تجميع حلقات النسيج الانتهاء من تشكيل أنبوبي والكسب غير المشروع الأوعية الدموية. ميزة لهذه الطريقة، ويطلق عليه "حلقة زرع الطريقة،" هو أن أي نوع من الخلايا الملتصقة يمكن المصنف في الإعداد لوحة وحلقات الأنسجة أو أنابيب من أي حجم الحاجة للتطبيق المطلوب يمكن توليدها عن طريق ببساطة تعديل إدراج دليل. لا تزال تقنيات نسبية في الأنسجة حلقات الهندسة خلق من الأنسجة يصعب على نطاق وو 15 و 16 التي تتطلب إعادة تصنيعها من قوالب لكل الحجم المطلوب. بالإضافة إلى ذلك، قدمت ترقيع الأوعية الدموية باستخدام هذه الطريقة يمكن إنتاجد في 2-3 أسابيع، عدة أسابيع أسرع مقارنة مع السفن المهندسة أخرى. 6 بالنسبة للعيادة، ويمكن هذه المرة التناقض فارقا كبيرا في علاج المريض المتدهور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خلية التحضير الثقافة
- الاستفادة من الشريان الأبهر خلايا العضلات الملساء الإنسان شراؤها تجاريا.
- الحفاظ على الخلايا في العضلات الملساء وسائل الاعلام نمو الخلايا تتكون من 88.6٪ 231 وسائل الإعلام، 0.1٪ لكل منهما من الانسولين المؤتلف الإنسان (RH-الأنسولين)، المؤتلف عامل نمو الخلايا الليفية الإنسان (RH-جمعية جيل المستقبل)، المؤتلف عامل نمو البشرة البشري (RH-جمعية جيل المستقبل)، وحمض الاسكوربيك. و 5٪ في كل من مصل بقري جنيني (FBS) ولام الجلوتامين. و1٪ مضاد حيوي / مضاد فطري.
ملاحظة: كل عامل النمو، FBS ولام الجلوتامين يتم شراؤها بوصفها مجموعة نمو وسائل الإعلام الأوعية الدموية. - وسائل الإعلام تغيير كل 48 ساعة حتى خلايا حوالي 90٪ متموجة وجاهزة للزرع الأنسجة.
- تخزين الخلايا في حاضنة في بين التغييرات الوسائط للتوسع.
2. إعداد 3D مطبوعة مدرجات وسيليكون مخصص مصبوب لوحات
- استخدام طابعة 3D التجارية (على سبيل المثال، المكرر البسيطة) ل3D طباعة إدراج لوحة.
- استخدام المرجعأون مصدر تصميم البرمجيات 3D مثل خلاط لخلق 3D نماذج للقذائف الخارجي والمشاركات المطبوعة.
- تصدير ملف برنامج التشغيل للنموذج عن طريق شكل تنسيق stl السماح لقابلية لبرنامج الطابعة 3D ل.
- إنتاج المشاركات المطبوعة وقذائف الخارجي باستخدام بولي (حامض اللبنيك) خيوط (PLA) تحميلها في الطابعة 3D.
- بعد الطباعة، إجراء 30 دقيقة نقع في 70٪ -100٪ محلول الإيثانول لتعقيم كل إدراج.
- إعداد وكيل 01:10 علاج لقاعدة خليط البوليمر بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) سيليكون البوليمر والسماح للخليط لديغا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- تحديد أحجام بتري طبق تستخدم صغير (35 مم) والمتوسط (60 ملم)، وكبير (100 ملم).
- إضافة 2 مل، 4 مل و 6 مل من السيليكون غير مخمر إلى كل لوحة صغيرة ومتوسطة وكبيرة، على التوالي، وخلق طبقة رقيقة عبر الجزء السفلي بأكمله من طبق بتري.
- خلق وظائف لوحة صغيرة عن طريق سكب PDMS إلى100 لوحة مم على ارتفاع 7 ملم وتسمح لعلاج على طبق ساخن عند 60 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات. ثم استخدام خزعة لكمة 5 مم لكمة من المشاركات أسطواني. استخدام كمية صغيرة من PDMS غير مخمر لتأمين كل PDMS اسطوانة ووسط كل لوحة صغيرة.
- لوحات المتوسطة والكبيرة، وذلك قبل استكمال علاج من PDMS في الجزء السفلي من لوحة، ضع المشاركات 3D المطبوعة 10 مم و 20 مم في القطر مركزيا في كل لوحات المتوسطة والكبيرة، على التوالي. لوحات كبيرة، بالإضافة إلى وضع 3D المطبوعة الغلاف الخارجي حوالي 66.7 ملم في تساوي البعد قطر من منصبه.
- يسمح لكل طبق لعلاج في الهواء الطلق على طبق ساخن عند 60 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات، والسماح 18 ساعة لإزالة الغازات من البوليمر. إصلاح المكونات المطبوعة على لوحة في المنطقة المناسبة والتوجيه كما رأينا في الشكل 1.
- إضافة حل 70٪ من الإيثانول مع 30٪ من الماء المقطر لمدة 30 دقيقة إلى داخل كل جيش التحرير الشعبى الصينىقسم التدريب والامتحانات للتعقيم ثم تغطي كل لوحة.
- بعناية نضح الإيثانول من كل لوحة والسماح للهواء الجاف.
- ترتيب كل لوحة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC) بجانب لها غطاء، وجها. فضح لوحات والأغطية للأشعة فوق البنفسجية تحت BSC لمدة 30 دقيقة لإتمام عملية التعقيم. يتم تنفيذ تقنية معقمة مع كل خطوة بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
3. إعداد الليفين هيدروجيل، البذر مع خلايا العضلات الملساء وصيانة لوحات
- مزيج حل من هلام الليفين التي تحتوي على وسائط النمو + 0.01٪ TGF-β1 في كميات من 0.5 مل، 1.1 مل و1.81 مل لأحجام وحة صغيرة ومتوسطة وكبيرة، على التوالي.
- إضافة 40 ميكرولتر، 88.4 ميكرولتر و 145 ميكرولتر من الثرومبين، من الأسهم من 100 U / مل، إلى وسائل الإعلام من كل لوحة صغيرة ومتوسطة وكبيرة، على التوالي. دوامة بلطف كل لوحة من جهة لضمان الثرومبين يتم خلط بالتساوي في وسائل الاعلام.
- المقبل، إضافة 1601؛ L، 354 ميكرولتر و 580 الفيبرينوجين ميكرولتر من الأسهم من 20 ملغ / مل، وانخفاض الحكيم دائري إلى خليط الثرومبين وسائل الإعلام إلى كل لوحة صغيرة ومتوسطة وكبيرة، على التوالي. دوامة بلطف باليد لضمان خلط وتوزيع هيدروجيل إلى حتى طبقة.
- السماح هيدروجيل إلى علاج لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- يعرض للتريبسين خلايا العضلات الملساء توسعت في لوحات ثقافة الخلية 150 ملم وأجهزة الطرد المركزي وفقا لبروتوكولات موحدة. يجب أن بيليه معلق مما يؤدي إلى 3 مل من وسائل الاعلام التمايز تتألف من 98٪ - 231 وسائل الإعلام، 1٪ FBS و 1٪ مضاد حيوي / مضاد فطري.
- بقوة خلط الخلايا عن طريق المعايرة صعودا وهبوطا مع ماصة 2 مل لتفريق أي كتل الخلايا. عدد الخلايا مع عدادة الكريات وإنشاء تعليق خلية من 2 × 10 6 خلية / مل، 1.0 × 10 7 خلية / مل و 1.4 × 10 7 خلية / مل لوحات صغيرة ومتوسطة وكبيرة، على التوالي.
- إضافة 1 مل من كل كثافة تعليق خليةالزراعة العضوية الموافق 50 مل المخروطية وصفت الصغيرة والمتوسطة والكبيرة. إعداد إضافي 50 مل المخروطية على هذا النحو لكل حلقة الأنسجة الإضافية المطلوبة.
- إضافة وسائط التمايز إلى كل المخروطية للحصول على كميات البذر النهائية من 2 مل، 4 مل و 5 مل لكل سفينة صغيرة ومتوسطة وكبيرة، على التوالي. ثم، الماصة بعناية حل الخلية قطرة من الحكمة على رأس هيدروجيل مستعد في كل لوحة المقابلة.
- مكان لوحات في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- وسائل الإعلام التمايز تغيير كل 48-72 ساعة لكل لوحة. في حالة لوحة أكبر، وتغيير وسائل الاعلام في البداية بعد 24 ساعة، ثم تغييره كل 48-24 ساعة للتعويض عن كثافة الخلية البذر كبيرة.
- بعد 2-4 أيام والحلقات سيكون قد تعاقدت تماما في نحو آخر، إضافة 10 ميكرولتر، 20 ميكرولتر و 35 ميكرولتر من TGF-β1 إلى كل حلقة صغيرة ومتوسطة وكبيرة، على التوالي. بعد التعرض للTGF-β(1)؛ لمدة 24 ساعة على الأقل، وخواتم جاهزة ليتم التعامل معها.
4. الجمعية الأوعية الدموية بناء وصيانة
- قبل تلفيق بناء الأوعية الدموية النهائي، يتم إنشاء حاوية المتخصصة لعقد سفينة الانتهاء.
- للسفينة صغيرة، خلق لوحة طويلة لعصابة التراص عن طريق قطع الجزء 2 بوصة من أعلى مل أنبوب مخروطي 50 البولي، ثم PDMS الغراء حافة القطع في لوحة 35 ملم. استخدام غطاء مخروطي كما غطاء لوحة.
- للسفينة حلقة طويل القامة المتوسطة والكبيرة التراص لوحات، وقطع 1.75 بوصة أنبوب البولي قطرها إلى 2.5 بوصة أقسام بالطول لتكون بمثابة الجدران لوحة طويل القامة. لقيعان لوحة طويل القامة، وقطع ورقة البولي 0.125 بوصة سميكة إلى 2 بوصة قطع دائرة قطرها. باستخدام الاكريليك الاسمنت المذيبات، ربط قسم أنبوب البولي إلى التعميم قطع قطعة. استخدام غطاء من طبق بتري 60 ملم والغطاء لوحة طويل القامة.
- 3D صالمشاركات rint 5 و 10 و 20 مم في القطر، و 50 ملم في الطول.
- إضافة 10 مل من السيليكون غير مخمر في كل حاوية. قبل علاج كامل للPDMS، مركزيا وضع كل وظيفة بإنشائه في الخطوة 4.1.3 في كل حاوية صغيرة ومتوسطة، وكبيرة.
- السماح لعلاج على مجموعة لوحة الساخن إلى 60 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات.
- تعقيم بمحلول مكون من 70٪ من الإيثانول مع 30٪ من الماء المقطر لمدة 30 دقيقة.
- بعناية نضح الإيثانول من كل حاوية ومن ثم السماح للهواء الجاف في ش. التالي، وترتيب الحاويات في غطاء محرك السيارة مع كل لوحة وضعت بجانب لها غطاء، وجها. كشف الحاويات لضوء الأشعة فوق البنفسجية تحت BSC لمدة 30 دقيقة إضافية لمزيد من التعقيم. استخدام تقنية معقمة مع كل خطوة بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
- باستخدام ملقط دقيق جدا، وإزالة بعناية كل توالت بإحكام العضلات الملساء حلقة هيدروجيل من منصبه ونقل إلى حاوية أكبر المقابلة مع الوظائف طويل القامة.
- استخدام زوج منملقط في كل جهة، ورفع جانب واحد من عصابة من آخر، ثم من جهة أخرى. كن حذرا لحماية والحفاظ على التجويف.
- إجراء نقل مع هذا الأسلوب بكلتا اليدين، انزلاق أول فريق واحد، ثم الجانب الآخر من الحلبة على آخر طويل القامة. باستخدام طيف والحركات تدريجية، والعمل محيطي، ودفع ببطء تسدل على آخر طويل القامة. بعد ذلك كومة حلقات الأنسجة حتى تم الحصول على طول سفينة المطلوب، مع كل حلقة يستمد ما يقرب من 1-2 ملم من الطول إلى بناء الانتهاء.
- مع كومة حلقة المتمركزة على 3D المطبوعة المشاركات طويل القامة، وتحويل لوحة بحيث منصب موازية مع سطح العمل.
- باستخدام micropipette، إضافة 40 و 80 و 160 ميكرولتر من الثرومبين بتركيز 100 U / مل بلطف على السطح الخارجي من كل سفينة صغيرة ومتوسطة وكبيرة، على التوالي. وفي الوقت نفسه إضافة الثرومبين، وتناوب ببطء لوحة لضمان حتى تغطية جميع الأسطح للبناء.وستكون هذه هي قاعدة للالغراء الليفين تستخدم لتأمين بناء حلقة المكدس في الأيام الأولى بعد البناء.
- المقبل، إضافة 40 و 80 و 160 ميكرولتر من الفيبرينوجين بتركيز 20 ملغ / مل لكل بناء صغيرة، ومتوسطة، وكبيرة، على التوالي، باستخدام micropipette في حين تناوب على بناء بسرعة. والثرومبين والفيبرينوجين المسارعة إلى هلام الراسخ مرة واحدة مختلطة. ويرجع ذلك إلى وقت المعالجة قصيرة، تطبيق الفيبرينوجين بسرعة وبشكل متساو قدر الإمكان.
- إضافة 20 مل من وسائل الاعلام التمايز إلى كل حاوية عقد بناء. سفن مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. تغيير وسائل الاعلام كل 3-5 أيام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظاهر هنا هو تلفيق من 3 أحجام مختلفة الكسب غير المشروع الأوعية الدموية المهندسة (الشكل 1)، وتبين أن حلقة زرع الطريقة (RSM) غير قابلة لل. لإثبات إمكانية تطبيقها، وأحجام السفن مختلفة 3 اختار متطابقة مع حجم السفينة البشري الفعلي لالأمامي الأيسر النازل الشريان (صغير، التجويف قطرها = 4 مم) 17، تنازلي الشريان الأبهر (وسيطة، التجويف قطرها = 10 مم) والأبهر الصاعد (عموما؛ التجويف قطرها = 20 مم) 18. سمك الجدار حوالي 500 ميكرون لحلقات صغيرة، وحوالي 1500 ميكرون لكل من الحلقات المتوسطة والكبيرة. حيث تم بناء كل سفينة يتبين من التراص 6 حلقات، يعادل طوله حوالي 6 مم للسفينة صغيرة و 9 مم للسفن المتوسطة والكبيرة. ويستند طول على سمك الجدار من كل حلقة على حدة.
التحليل النسيجي كشفالخلوية عالية في جميع الأحجام حلقات (الشكل 2). مادة حمراء ترسم هلام الليفين. في حلقات صغيرة، ينظر إلى كمية صغيرة من هلام الليفين المتبقية على الحافة الخارجية للحلقة. في حلقات أكبر، وتتخللها بعض هلام الليفين مع المحتوى الخلوي. في وصمة عار ثلاثي الألوان وماسون، مؤشرات على إنتاج الكولاجين (تميزت الأزرق) يمكن أن ينظر إليه في الحلقات المتوسطة والكبيرة.
لتحديد النمط الظاهري الخلية التالية تشكيل حلقة، وقد تم تحليل حلقات النسيج باستخدام المناعي للأجسام المضادة لألفا العضلات الملساء الأكتين (SMA) والتروبوميوزين (الشكل 3). وكانت جميع الأحجام حلقة إيجابية لكل من الأجسام المضادة، والتحقق من أن النمط الظاهري العضلات الملساء والمحافظة عليها.
تم إجراء اختبار الشد على حلقات مختلفة الحجم لتحديد الخصائص الميكانيكية الخاصة بهم (الشكل 4). يو تمتد، والمطاط وكال جهاز اختبار كان يستخدم لاختبار الشد حلقات الصغيرة والمتوسطة والسفن، بينما تم استخدام INSTRON إلى الشد اختبار حلقات الكبيرة والسفن. معامل المرونة (E)، في نهاية المطاف قوة الشد (UTS) وقوة فشل جمعت البيانات (FS). ولوحظ وجود اتجاه ثابت مع زيادة قوة الربط لزيادة حلقة وحجم السفينة.
خلية البذر العدد المطلوب لخلق حلقات متنوعة الحجم زاد حوالي خطيا مع مساحة البذر (الشكل 5). من أجل خلق حلقات أكبر، وهناك حاجة إلى 14 مليون على الأقل الخلايا لإنشاء الشريان الأورطي البطني حلقات الحجم.
مداخن ستة الدائري، أو السفن، تم اختبار لقدرتها على الصمود أمام التدفق. تم تحميل بنيات في نظام نضح مبنية خصيصا (الشكل 6) وتعرض لتدفق لمدة تصل إلى 5 دقائق في معدلات تدفق 100-417 مل / دقيقة. وكانت السفنقادرة على الصمود أمام التدفق. وقد لوحظ تسرب بسيط في نهايات السفينة، بناء الروابط إلى نظام الارواء.
الشكل 1: بناء السفن المهندسة تحجيمها. أ) رسم تخطيطي لعملية رفع السفن هندسيا، بدءا من إعداد لوحة، وبذر الخلايا وبناء السفن. تظاهر ثلاثة مختلفة الحجم ب) حلقات و) سفن C. D) سفينة كبيرة التمثيلية هي البيولوجية تماما وتشبه الأنسجة الطبيعية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل النسيجي. رونغ> H & E والبقع ثلاثي الألوان ماسون تظهر الخلوية قابلة للحياة في جميع أنحاء سمك عصابة لجميع الأحجام الحلبة. ثلاثي الألوان البقع تكشف مجالات إنتاج الكولاجين أشار الزرقاء (الأسهم الزرقاء). وأظهرت حلقات كبيرة هلام الليفين يتخلل، من المحتمل بسبب قابلة للطي من مساحة سطح أكبر نسبيا من ورقة الخلية. أشرطة النطاق: حلقات صغيرة = 200 ميكرون. حلقات وسيطة = 200 ميكرون. وخواتم كبيرة = 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل المناعي للعلامات العضلات الملساء. وكانت جميع الأحجام حلقة إيجابية لسلسة بروتينات العضلات مقلص α-العضلات الملساء الأكتين (SMA) والتروبوميوزين (TM). الحانات النطاق = 200 ميكرون.تحميل / 55322 / 55322fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل اختبار الشد. وأظهرت منحنيات الإجهاد والانفعال لجميع الأحجام من الحلقات والسفن والاتجاه العام للزيادة في قوة الربط مع زيادة في حجم خاتم / السفينة. وقد امتدت حلقات والأوعية محيطي. وكانت المعلمات المقدرة على الرسوم البيانية معامل المرونة، قوة الشد في نهاية المطاف وقوة فشل (المدرجة في الجدول 1). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: خلية البذر عدد العلاقة البذر الأمواجمنطقة الآس. واستنادا إلى خلايا العضلات الملساء الأبهر الإنسان. يتم تعريف مساحة كمنطقة في لوحات تشكيل عصابة بين مركز آخر والجدار لوحة أو الغلاف الخارجي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: سفينة ستة الدائري تعرض لتحليل نضح. أ) نظام نضح المدمج مخصص للاختبارات التدفق. ب) سفينة المهندسة تحميلها في نظام الارواء. كانت ثلاث سفن نضح اختبار للكشف عن التسربات لمدة تصل إلى 5 دقائق في ظل ظروف التدفق. وظلت هذه السفن مستقرة في ظل التدفق، مع تسرب بسيط في السفينة نهاية الموصلات تعلق على أنابيب النظام. الرجاء الضغط هنا للمشاهدةنسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل الرسوم المتحركة 1: مظاهرة من تدفق نضح من خلال سفينة هندسيا. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
| صغير | متوسط | كبير | |||||
| خواتم | معامل مرونة (باسكال) | 13.6 ± 2.25 | (ن = 6) | 14.5 ± 1.2 | (ن = 3) | 17.2 ± 2.2 | (ن = 4) |
| في نهاية المطاف قوة الشد (كباسكال) | 34.5 ± 10.2 | 39.6 ± 2.98 | 50.9 ± 10.6 | ||||
| فشل القوة (باسكال) | 34.5 ± 10.2 | 39.6 ± 2.98 | 50.9 ± 10.6 | ||||
| أوعية | معامل مرونة (باسكال) | 49.7 ± 2.80 | (ن = 3) | 59.8 ± 3.90 | (ن = 2) | 79.8 ± 10.1 | (ن = 2) |
| في نهاية المطاف قوة الشد (باسكال) | 115 ± 6.90 | 137 ± 12.0 | 192 ± 86.9 | ||||
| فشل القوة (باسكال) | 96.2 ± 12.2 | 60.7 ± 12.1 | 173 ± 92.2 | ||||
الجدول 1: خصائص الشد من الحلقات والأوعية تحجيمها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعرض حلقة زرع الطريقة مزايا متعددة على الأنسجة المهندسة وتقنيات بناء الأوعية الدموية الحالية. ويمكن تكييف RSM لإنشاء السفن البشرية من أي حجم ببساطة عن طريق تخصيص منصب والغلاف الخارجي الأبعاد. يسمح لدينا وسيلة لتطوير السفن خالية من البوليمر المهندسة تتكون فقط من خلايا الإنسان والمهينة بسرعة الدعم المادي وجدت في عملية التئام الجروح في الجسم الطبيعية. ومن المعروف ترقيع البوليمر أن يسبب عودة التضيق في العيادة، ويمكن أن تصبح مشكلة إذا الواردة في ترقيع هندسيا. يحتاج إلى تعديل لكل حلقة مختلفة الأنسجة حجم عدد البذر الخلية. ويظهر رسم بياني لعدد الخلايا إلى منطقة سطح البذر في الشكل 5 من خلالها عدد البذر يمكن أن يقترب و / أو استقراء. وتجدر الإشارة إلى أن نوع من الخلايا المستخدمة هنا هي الأورطي خلايا العضلات الملساء الإنسان. لتكييف RSM إلى أنواع مختلفة من الخلايا، حجم الخلية ومعدل انتشار تحتاج إلى أن تؤخذ بعيننظر فيها وبذر الأمثل كثافة تحدد. على سبيل المثال، أنشأنا أيضا حلقات الليفية الإنسان باستخدام RSM، ولقد وجدت أن 2x أخرى على الأقل هناك حاجة لعدد من الخلايا مقارنة SMCS. أي الطول المطلوب من السفينة يمكن أن يبنى من خلال إضافة الحلقات. وقد تم استزراع مداخن حلقة لمدة تصل إلى 2 أشهر، وظلت مستقرة. حلقات المتوسطة والكبيرة على حد سواء أبقى في مناسبة 1500 ميكرون سمك الجدار على الرغم من أنها هي التي شيدت في كل لوحة 60 ملم و 100 ملم، على التوالي، من خلال تصنيف الغلاف الخارجي في لوحة 100 ملم. وهذا يدل على فائدة من القشرة الخارجية للسيطرة والحصول على سمك الجدار المناسب لسفينة معينة. في الخطوة 3.3.1، يضاف TGF-β1 لأنه من المعروف أنه لتحفيز إنتاج الكولاجين 19 ولها تأثير الملحوظ تشديد حلقات. مرة واحدة الحلقات قد لف تماما، يضاف جرعة واحدة من TGF-β1 في الخطوة النهائية، والحلقات جاهزة للاستخدام 1 يوم في وقت لاحق. TGF-β1 يفعل تعزيز إنتاج الكولاجين في الحلقات، كما رأينا في الصور ثلاثي الألوان (الشكل 2).
الخلايا في حلقات صغيرة هي أكثر جولة والمدمجة، في حين أنه في أحجام أكبر 2، الخلايا على طول الحواف الخارجية عرض درجة من التوافق مع حافة النسيج وجنبا إلى جنب مع خلايا محاذاة أخرى. قد يشير هذا الأخير مرحلة لاحقة من النضج الخلية، وتطورت من محتوى الخلية العالي في حلقات أكبر، وبالتالي درجة أكبر من الإشارات بين الخلايا لتشجيع النضج. التناثر هلام الليفين في حلقات أكبر قد يشير إلى ورقة خلية أكبر تميل إلى أضعاف قليلا لأنها لفة. التقطت الصور النسيجية تظهر هذه الظاهرة 1 اليوم التالي لفة حلقة كاملة حتى- وبالتالي فإنه من المفهوم أن جل الليفين، والتي تأخذ 2 أسابيع لتتحلل في الثقافة، وستظل موجودة. يجب زراعة الحلقات لمدة 2 أسابيع على الأقل تحط من هلام الليفين، تاركا وراءه بناء الخلوي بشكل كامل.
الإقليم الشمالي "> ألفا العضلات الملساء الأكتين (SMA) تشكل خيوط رقيقة تسهل الانكماش والتروبوميوزين هو بروتين مقلص 20، 21 وكان كل من SMA والتروبوميوزين موجودة في جميع حلقات حجم، مع أقوى، إشارة وزعت أكثر بالتساوي في المتوسط حلقات. قد تكون هذه الظاهرة يعود إلى درجة أعلى من كثافة الخلايا وتنظيم، وتحفيز زيادة في التنمية مقلص طريقة.ويشير معامل مرونة مرونة من الحلقات، وE زيادة من الصغيرة الى الكبيرة حلقات يدل على وجود زيادة في إنتاج الكولاجين والإيلاستين. قوة الشد في نهاية المطاف هو أعلى قوة تحمل من قبل عصابات دون كسر. قوة الفشل هو نقطة الفشل الأنسجة. ليرن، UTS يساوي FS. للسفن، UTS هو أكبر من FS، مما يدل على ان ينسب قوة في نهاية المطاف من السفينة إلى مزيج من مساهمة الميكانيكية من جميع الحلقاتفي وعاء، وويرجع ذلك إلى أضعف حلقة نقطة الفشل.
قوة من السفن هندسيا لدينا تكمن في نطاق كيلو باسكال، في حين أن السفن الإنسان الأم لديها القوة في نطاق ميجا باسكال. من أجل تعزيز سفننا نحو ذلك من السفن الأم، نحن نحقق التقنيات لزيادة إنتاج المصفوفة خارج الخلية، وهي أن من الكولاجين والإيلاستين. ويجري حاليا تطبيق عوامل النمو التي تعزز الكولاجين والإيلاستين الإنتاج إلى حلقات جهدنا لتحقيق ما إذا كانت خصائص الشد سيزداد.
بالإضافة إلى الخواص الميكانيكية، واتخاذ تدابير وظيفية من تقلص العضلات هي ذات الصلة لأداء السفينة. تنشيط العضلات وتقلص بفعل عوامل مثل أستيل و epinephrine يمكن استخدامها لاختبار العضلات قوة مقلص. ويجري النظر في مثل هذه التجارب للدراسات المستقبلية.
وبشكل عام، تظهر نتائجنا أن حلقة زرع الطريقة يمكن زيادتها بسهولةلتحقيق مجموعة من الأحجام الأنسجة الوعائية هندسيا. رفع لأكبر السفن الإنسان، مثل 40 مم التجويف الشريان الأورطي قطر، من المرجح أن تتطلب تطوير الوعائية الأوعية، والأوعية الدموية الدقيقة الموجودة طبيعيا داخل الأوعية كبيرة الحجم، التي لدينا مختبر يتطور حاليا. وبالإضافة إلى ذلك، طبقة الخلايا البطانية (أي البطانية) التي عادة ما يبطن تجويف طبقة وسائل الاعلام مهم لإنشاء ديناميكا الدم السليم في وعاء. مختبرنا تعمل حاليا على إنشاء البطانية في منطقتنا كومة حلقة SMC باستخدام خلايا بطانة الأوعية الدموية الإنسان. مع هذه التقنيات مجتمعة، فإن السفن هندسيا لديها أكبر للتطبيق إلى العيادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر لدينا زميل لام الزملاء مختبر عمار شيشتي وBijal باتيل للحصول على المساعدة الكريمة مع بعض من ثقافة الأنسجة والخلايا. تم توفير التمويل من جامعة واين ستايت النانوي زمالة (CBP)، للبدء في إنشاء صناديق ومعهد بحوث القلب والأوعية الدموية غرانت البذور (MTL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Aortic Smooth Muscle Cells | ATCC | PCS-100-012 | vascular smooth muscle cells |
| Medium 231 | Gibco (Life Technologies | M-231-500 | media specific to vascular smooth muscle cells |
| Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PSC-100-042 | growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability |
| Replicator Mini 3D printer | MakerBot | N/A | 3D printer |
| Poly(lactic acid) 3D ink (PLA) | MakerBot | N/A | 3D printer filament |
| Poly(dimethlysiloxane) (PDMS) | Ellworth Adhesives | 3097358-1004 | polymer for gluing plate parts |
| Fibrinogen | Hyclone Labratories, Inc. | SH30256.01 | fibrin gel component |
| Thrombin | Sigma Life Sciences | F3879-5G | fibrin gel component |
| Tranforming Growth Factor-Beta 1 | PeproTech | 100-21 | growth factor for stimulating collagen production |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | for cell counting |
| Polycarbonate tubing | US Plastics | PCTUB1.750X1.625 | material for making tall, ring stacking plates |
| Polycarbonate sheet | Home Depot | 409497 | material for making tall, ring stacking plates |
| Adhesive polymer solvent | SCIGRIP | 10799 | material for making tall, ring stacking plates |
| Instron 5940 | Instron | N/A | tensile testing machine |
| U-Stretch | Cell Scale | N/A | tensile testing machine |
| Smooth Muscle Actin | MA5-11547 | Thermo Fisher | antibody |
| Tropomyosin | MA5-11783 | Thermo Fisher | antibody |
References
- Luciani, G. B., et al. Operative risk and outcome of surgery in adults with congenital valve disease. ASAIO J. 54 (5), 458-462 (2008).
- Lawson, J. H., et al. Bioengineered human acellular vessels for dialysis access in patients with end-stage renal disease: two phase 2 single-arm trials. Lancet. 14 (387), 2026-2034 (2016).
- McAllister, T. N., et al. Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study. Lancet. 373 (9673), 1440-1446 (2009).
- Wystrychowski, W., et al. First human use of an allogeneic tissue-engineered vascular graft for hemodialysis access. J Vasc Surg. 60 (5), 1353-1357 (2014).
- Konig, G., et al. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30 (8), 1542-1550 (2009).
- Gui, L., et al. Construction of tissue-engineered small-diameter vascular grafts in fibrin scaffolds in 30 days. Tissue Eng Part A. 20 (9-10), 1499-1507 (2014).
- Sundaram, S., Echter, A., Sivarapatna, A., Qiu, C., Niklason, L. Small-diameter vascular graft engineered using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells. Tissue Eng Part A. 20 (3-4), 740-750 (2014).
- Quint, C., Arief, M., Muto, A., Dardik, A., Niklason, L. E. Allogeneic human tissue-engineered blood vessel. J Vasc Surg. 55 (3), 790-798 (2012).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 31 (108), 9214-9219 (2011).
- Dahl, S. L., et al. Readily available tissue-engineered vascular grafts. Sci Transl Med. 2 (68), (2011).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Meier, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells alter remodeling of completely biological engineered grafts implanted into the sheep femoral artery. J Cardiovasc Transl Res. 7 (2), 242-249 (2014).
- Pinnock, C. B., Meier, E. M., Joshi, N. N., Wu, B., Lam, M. T. Customizable engineered blood vessels using 3D printed inserts. Methods. S1046-2023 (15), 30184-30185 (2015).
- Blakely, A. M., Manning, K. L., Tripathi, A., Morgan, J. R. Bio-Pick, Place,and Perfuse: A New Instrument for Three-Dimensional Tissue Engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (7), 737-746 (2015).
- Gwyther, T. A., et al. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).
- Fearon, W. F., et al. Changes in coronary arterial dimensions early after cardiac transplantation. Transplantation. 27 (6), 700-705 (2007).
- Erbel, R., Eggebrecht, H. Aortic dimensions and the risk of dissection. Heart. 92 (1), 137-142 (2006).
- Ha, D. M., et al. Transforming growth factor-beta 1 produced by vascular smooth muscle cells predicts fibrosis in the gastrocnemius of patients with peripheral artery disease. J Transl Med. 14, 39 (2016).
- Skalli, O., et al. Alpha-smooth muscle actin, a differentiation marker of smooth muscle cells, is present in microfilamentous bundles of pericytes. J Histochem Cytochem. 37 (3), 315-321 (1989).
- von der Ecken, J., et al. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
