Summary
Skalerbar manipulerede blodkar ville forbedre klinisk anvendelighed. Brug af let betragtelige 3D-trykte vejledninger, blev ringe af vaskulær glat muskulatur skabt og stablet til en rørformet form, og danner et vaskulært transplantat. Transplantater kan være dimensioneret til at opfylde området af humane koronararterie dimensioner ved blot at ændre 3D-trykte vejledning størrelse.
Abstract
Koronararteriesygdom fortsat en førende dødsårsag, der påvirker millioner af amerikanere. Med manglen på autologe vaskulære transplantater rådighed, manipuleret transplantater tilbyde et stort potentiale for patientbehandlingen. Men manipuleret vaskulære transplantater er generelt ikke let skalerbar, kræver fremstilling af brugerdefinerede forme eller polymer rør med henblik på at tilpasse til forskellige størrelser, som udgør en tidskrævende og bekostelig praksis. Humane arterier varierer i lumen diameter fra ca. 2,0 til 38 mm og i vægtykkelse fra ca. 0,5-2,5 mm. Vi har skabt en metode, kaldet den "Ring Stacking Method", hvor variable størrelse ringe af væv af den ønskede celletype, demonstrerede her med vaskulære glatte muskelceller (SMC'er), kan oprettes ved hjælp styrene på center stillinger for at kontrollere lumen diameter og ydre skaller at diktere godstykkelsen. Disse væv ringe er derefter stablet at skabe en rørformet konstruktion, der efterligner den naturlige form af et blodkar. Fartøjet Længden kan be skræddersyet ved blot at stable det antal ring, der kræves for at udgøre længden nødvendig. Med vores teknik, kan væv af rørformede typer, svarende til et blodkar, let fremstilles i forskellige dimensioner og længder for at opfylde behovene i klinikken og patienten.
Introduction
I behandling af koronararteriesygdom (CAD), er en patientens egne blodkar høstes som implantatmateriale til bypass-kirurgi. Men oftentimes, syge patienter ikke har levedygtige fartøjer til at donere til sig selv, og i tilfælde, hvor de gør, donor websted forårsager betydelig yderligere skade og har en alvorlig risiko for infektion. 1 Udviklet vaskulære transplantater kunne fylde dette behov. Skalerbarhed er af allerstørste betydning for engineering fartøjer for at opfylde den brede vifte af patientens krav fartøj størrelse. Men de nuværende metoder til tekniske skibe er ikke let skalerbar, og kræver typisk reproduceres af komplekse forme eller polymerstativer. Mest manipuleret transplantater enten anvende en polymer rørformet stillads, der podes med vaskulære fibroblaster, glatte muskelceller eller endothelceller; eller rulle en celle ark omkring en dorn for at skabe et væv rør. To manipuleret kargrafter i kliniske forsøg er baseret på en decellularized polymer-ECM platform. 2, 3, 4 Polymer transplantater til rådighed til brug i vaskulær reparation er allerede kendt for at have problemer med åbenhed, som kan opstå som et stort problem med langsigtet anvendelse af et transplantat med en polymer til stede. Rørformede forme er blevet anvendt til at fabrikere helt cellulære fartøjer, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, hvilke procedurer ville kræve ekstra design og værktøjsfremstilling for brugerdefinerede forme for at fremstille fartøjer i forskellige størrelser .
Den heri beskrevne fremgangsmåde omfatter en hidtil ukendt teknik til at skabe let skalerbar manipuleret vaskulærtransplantater bruger tilpasses 3D trykte indsatser og traditionelle kultur plader. 14 Celler podes i plader med indsatse af en central post og ydre skal. De efterfølgende kontrol lumen diameter og tillader cellemonolaget til selv samle ind i en ring af væv. Den ydre skal kontrollen tykkelse af ringen, og således vægtykkelse af den endelige beholder. Tilbagelagt væv ringe derpå stablet til dannelse af en rørformet, vaskulært transplantat. Fordelen ved denne metode, betegnet "Ring Stacking Method", er, at for vedhængende celletype kan podes ind i pladen opsætning og væv ringe eller rør af enhver størrelse nødvendig for den ønskede anvendelse kan genereres ved tilpasse guide skær. Komparative teknikker i vævsmanipulering Oprettelse ringe af væv er fortsat svært at skala, 15, 16 trænger genfremstilling af forme til hver ønsket størrelse. Derudover vaskulære transplantater fremstillet ved hjælp af denne metode kan producered i 2-3 uger, flere uger hurtigere i forhold til andre manipuleret fartøjer. 6 For klinikken, kan denne gang uoverensstemmelse gøre en væsentlig forskel i behandlingen af en forværret patient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture Fremstilling
- Udnytte humane aorta glatmuskelceller købes kommercielt.
- Opretholde celler i glatte muskelceller vækstmedier sammensat af 88,6% 231 medier, 0,1% hver af rekombinant human insulin (rH-insulin), rekombinant human fibroblastvækstfaktor (rH-FGF), rekombinant human epidermal vækstfaktor (rH-FGF), og ascorbinsyre; og 5% hver af føtalt bovint serum (FBS) og L-glutamin; og 1% antibiotisk / antimykotisk.
Bemærk: Hver vækstfaktor, FBS og L-glutamin købes som en vaskulær vækstmedie kit. - Skift medier hver 48. time, indtil cellerne er omkring 90% sammenflydende og klar til væv såning.
- Opbevar celler i en inkubator i mellem medier ændringer for ekspansion.
2. Forberedelse af 3D Trykt Inserts og Custom silikone Støbt Plates
- Brug en kommerciel 3D-printer (f.eks Replicator Mini) til 3D udskrivning af plade skær.
- Brug open kilde 3D-design software som Blender til at skabe 3D-modeller af de trykte ydre skaller og indlæg.
- Eksporter modellens driver fil via en STL format giver mulighed for bærbarhed til 3D printerens software.
- Fremstille trykte stillinger og ydre skaller under anvendelse af poly (mælkesyre) glødetråd (PLA) er lagt i 3D-printer.
- Efter udskrivning, udføre en 30-minutters blød i en 70% -100% ethanol løsning til at sterilisere hver indsats.
- Forbered en 1:10 hærdemiddel til basispolymeren blanding af poly (dimethylsiloxan) (PDMS) siliconepolymer og lad blandingen afgasses ved stuetemperatur i 10 min.
- Definer petri dish størrelser, der anvendes som små (35 mm), mellemprodukt (60 mm), og store (100 mm).
- Tilsæt 2 ml, 4 ml og 6 ml af uhærdet silikone til hver lille, mellemliggende og store plade henholdsvis og skabe et tyndt lag over hele bunden af petriskålen.
- Opret indlæg for lille plade ved at hælde PDMS i en100 mm plade til en højde på 7 mm og tillade at hærde på en varm plade ved 60 ° C i ca. 2-3 timer. Brug derefter en 5 mm biopsi punch til punch ud cylindriske indlæg. Brug en lille mængde af uhærdede PDMS at fastgøre hver PDMS cylinder og til midten af hver lille plade.
- For de mellemliggende og store plader, inden fuldstændig hærdning af PDMS i bunden af pladen, placere 3D trykte stillinger 10 mm og 20 mm i diameter centralt i hver mellemliggende og store plader hhv. For de store plader, derudover placere en 3D trykt ydre skal ca. 66,7 mm i ækvidistance diameter fra posten.
- Tillad hver skål at hærde i fri luft på en varm plade ved 60 ° C i ca. 2-3 timer, hvilket tillader 18 timer til afgasning af polymeren. Fix trykte komponenter til pladen i den korrekte region og orientering som ses i figur 1.
- Tilsæt en opløsning af 70% ethanol med 30% destilleret vand i 30 minutter til indersiden af alle plates til sterilisering og derefter dække hver plade.
- aspireres forsigtigt ethanol fra hver plade og lad det lufttørre.
- Arranger hver plade i et biologisk sikkerhedsskab (BSC) ved siden af låget, med forsiden opad. Eksponere plader og låg for UV-lys under BSC i 30 minutter til fuldstændig sterilisering. Steril teknik udføres med hvert skridt efter UV eksponering.
3. Udarbejdelse af fibrin Hydrogel, Såning med glatte muskelceller og vedligeholdelse af plader
- Bland en opløsning af fibrin-gel indeholder vækstmedier + 0,01% TGF-β1 i mængden af 0,5 ml, 1,1 ml og 1,81 ml til små, mellem- og store plade størrelser hhv.
- Tilsæt 40 uL, 88,4 pi og 145 pi af thrombin, fra et lager på 100 U / ml, til medierne af hver lille, mellemliggende og store plade hhv. Vend forsigtigt hver plade med hånden for at sikre, at thrombin er jævnt blandet i medierne.
- Dernæst tilsættes 1601, L, 354 uL og 580 uL fibrinogen, fra en bestand på 20 mg / ml, drop-wise cirkulært til thrombin-media-blandingen til hver lille, mellemliggende og stor tallerken hhv. Vend forsigtigt med hånden for at sikre blanding og fordeling af hydrogel i et jævnt lag.
- Tillad hydrogel hærde i 10-15 minutter ved stuetemperatur.
- Trypsinisér glatte muskelceller ekspanderet i 150 mm celledyrkningsplader og centrifugeres i overensstemmelse med standardprotokoller. Den resulterende pellet bør resuspenderes i 3 ml differentiering medier bestående af 98% - 231 media, 1% FBS og 1% antibiotisk / antimykotisk.
- Kraftigt blande celler ved titrering op og ned med en 2 ml pipette til at bryde op nogen celleklumper. Tæl celler med en hæmocytometer og skabe en cellesuspension på 2 x 10 6 celler / ml, 1,0 x 10 7 celler / ml og 1,4 x 10 7 celler / ml i små, mellemliggende og store plader hhv.
- Tilsæt 1 ml af hver celle suspension intoa tilsvarende 50 mL konisk mærket lille, mellem og stor. Opsæt yderligere 50 mL konisk på denne måde for hver ekstra væv ring ønskes.
- Læg differentiering medier til hver konisk at opnå endelige seeding volumener 2 ml, 4 ml og 5 ml for hver lille, mellemliggende og store kar hhv. Derefter forsigtigt pipetteres celleopløsningen dråbevis oven på den forberedte hydrogel i hver tilsvarende plade.
- Placer plader i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
- Skift differentiering medier hver 48-72 timer for hver plade. I tilfælde af den større plade, ændre medier oprindeligt efter 24 timer, derefter ændre det hver 48-24 timer for at kompensere for det store celle podningstæthed.
- Efter 2-4 dage som ringene vil have helt kontraheret i mod posten, tilsæt 10 pi, 20 uL og 35 pi TGF-β1 til hver lille, mellem og stor ring, hhv. Efter eksponering for TGF-β; 1 i mindst 24 timer, ringe er klar til at blive håndteret.
4. Montering af Vascular Construct og vedligeholdelse
- Før fremstillingen af den endelige vaskulære konstruktion, er en specialiseret container skabt til at holde det færdige fartøj.
- For den lille fartøj, skabe en høj nummerplade for ring stabling ved at skære en 2-inch sektion fra toppen af en 50 ml polycarbonat konisk rør, og derefter PDMS lim skærekanten i en 35 mm plade. Brug den koniske låg som pladen låg.
- For den mellemliggende og store fartøj tall ring stabling plader, skære en 1,75-tommer diameter polycarbonat rør i 2,5 tommer sektioner på langs for at tjene som de høje plade vægge. For de høje plade bunde, skære en 0,125 tommer-tykke polycarbonat plader i 2-tommer cirkel diameter stykker. Brug af cement akryl opløsningsmiddel, binder afsnittet polycarbonat rør til det cirkulære udskårne stykke. Brug låget fra en 60 mm petriskål, når låget for høj nummerplade.
- 3D priv indlæg 5, 10 og 20 mm i diameter og 50 mm i længden.
- Tilsæt 10 ml af uhærdet silikone til hver beholder. Forud for fuldstændig hærdning af PDMS, centralt sted hvert indlæg oprettet i trin 4.1.3 i hver lille, mellemliggende og stor container.
- Lad hærde på en varmeplade indstillet til 60 ° C i 2-3 timer.
- Sterilisere med en opløsning af 70% ethanol med 30% destilleret vand i 30 minutter.
- aspireres forsigtigt ethanol fra hver beholder og derefter lad det lufttørre i BSC. Dernæst arrangere containere i hætte med hver plade placeret ved siden af låget, med forsiden opad. Udsætte containere til UV-lys under BSC i yderligere 30 minutter for yderligere sterilisation. Brug steril teknik med hvert skridt efter UV eksponering.
- Brug meget fine pincet, forsigtigt fjerne hvert stramt rullet glat muskulatur hydrogel ring fra sin post og overføre til dens tilsvarende større beholder med de høje stillinger.
- Brug et parpincet i hver hånd og løfte den ene side af ringen fra posten, og derefter den anden. Vær omhyggelig med at beskytte og bevare lumen.
- Udfør overførslen med denne to hånds metode, glidende første side, så den anden side af ringen på den høje stilling. Brug blide, gradvise bevægelser, og arbejder omkredsen, langsomt skubbe ringen ned på den høje indlæg. Efterfølgende stable væv ringe, indtil den ønskede fartøjslængde er blevet opnået, hvor hver ring tilsætte ca. 1-2 mm længde og den færdige konstruktion.
- Med ringen stakken placeret på de høje 3D trykte indlæg, drej pladen, så stillingen er parallel med arbejdsfladen.
- Med en mikropipette tilsættes 40, 80 og 160 pi af thrombin i en koncentration på 100 U / ml forsigtigt til den ydre overflade af hver lille, mellemliggende og store kar hhv. Under tilsætning af thrombin, langsomt dreje pladen for at sikre jævn dækning af alle overflader af konstruktionen.Dette vil være basis for fibrinklæberen anvendes til at fastgøre ringen stakken konstruktionen i de første dage efter anlæggelsen.
- Dernæst tilsættes 40, 80 og 160 pi af fibrinogen i en koncentration på 20 mg / ml til hver lille, mellemliggende og stor konstruktion, henholdsvis anvendelse af en mikropipette under rotation konstruktionen hurtigt. Den thrombin og fibrinogen hurtigt sat ind i en fast gel gang blandet. På grund af den korte hærdetid, anvende fibrinogen så hurtigt og jævnt som muligt.
- Der tilsættes 20 ml af differentiering medier til hver beholder indeholdende konstruktionen. Placer fartøjer i en 37 ° C inkubator indtil brug. Skift medier hver 3-5 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Demonstreret her er fabrikation af 3 forskellige manipuleret vaskulære graft størrelser (figur 1), der viser, at Ring Stacking Method (RSM) er skalerbar. For at bevise anvendelighed, de 3 forskellige skibsstørrelser valgt korrelat til den faktiske menneskelige fartøj størrelse til venstre forreste nedadgående arterie (lille, lumen diameter = 4 mm) 17, faldende aorta (mellemprodukt lumen diameter = 10 mm) og aorta ascendens (stor; lumendiameter = 20 mm) 18. Godstykkelse er omkring 500 um for de små ringe, og omkring 1500 um for både de mellemliggende og store ringe. Hvert fartøj demonstreret er bygget ved at stable 6 ringe, svarende til en længde på ca. 6 mm for lille fartøj og 9 mm for de mellemliggende og store skibe. Længde er baseret på vægtykkelsen af hvert enkelt ring.
Histologisk analyse vistehøj cellularitet i alle ringe størrelser (figur 2). Rødt materiale afgrænses fibrin gel. I små ringe, er en lille mængde af resterende fibringel set på den ydre kant af ringen. I de større ringe, blev nogle fibringel afbrudt med det cellulære indhold. I Massons Trichrome farve, kan indikationer af kollagen produktionen (markeret med blåt) ses i de mellemliggende og store ringe.
For at bestemme cellefænotype efter ringdannelse, blev væv ringe analyseret under anvendelse immunofluorescens for antistoffer til a-glat muskulatur actin (SMA) og tropomyosin (figur 3). Alle ringstørrelser var positive for begge antistoffer, kontrollere, at den glatte muskulatur fænotype blev opretholdt.
Trækprøvning blev udført på de forskellige størrelser ringe til at bestemme deres mekaniske egenskaber (figur 4). U-stretch, en generelt mekaniskcal test-enhed, blev brugt til at trækprøvning små og mellemliggende ringe og fartøjer, mens en Instron blev brugt til trækprøvning store ringe og fartøjer. Elasticitetsmodul (E), trækstyrke (UTS) og fiasko styrke (FS) data blev indsamlet. En konsekvent tendens blev observeret med stigende styrke korrelerer stigende ring og beholder størrelse.
Celle seeding der kræves, for at skabe de forskellige størrelse ringe steg næsten lineært med podning overfladeareal (figur 5). For at skabe større ringe, blev mindst 14 millioner celler nødvendig for at skabe den abdominale aorta mellemstore ringe.
Seks-ring stakke, eller fartøjer, blev testet for deres evne til at modstå strømning. Konstruktioner blev fyldt i en specialbygget perfusionssystem (figur 6) og underkastet flyde i op til 5 minutter ved ydelser fra 100 til 417 ml / min. Fartøjer varstand til at modstå strømning. Mindre lækker blev observeret ved skibet ender, ved stikkene til perfusion systemet.
Figur 1: Konstruktion af de skalerede manipuleret fartøjer. A) Diagram over processen med skalering manipuleret fartøjer, startende med plade forberedelse, cellepodning og fartøjets bygning. Demonstreret er tre forskellige størrelser B) ringe og C) fartøjer. D) Repræsentant stort fartøj er fuldstændig biologisk og ligner naturligt væv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Histologisk analyse. rong> H & E og Masson Trichrome pletter viser levedygtige cellularitet hele ringen tykkelse for alle ringstørrelser. Trichrome pletter afslører områder af kollagen produktion angivet med blå (blå pile). Store ringe viste fibringel afbrudt, sandsynligvis på grund af foldning af relativt større overfladeareal af cellelaget. Scale barer: små ringe = 200 um; mellemringe = 200 um; og store ringe = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Immunofluorescensanalyse for glat muskulatur markører. Alle ringstørrelser var positive for glat muskulatur kontraktile proteiner α-glat muskulatur actin (SMA) og tropomyosin (Tm). Scale barer = 200 um.belastning / 55.322 / 55322fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Trækprøvning analyse. Stress-strain kurver for alle størrelser af ringe og fartøjer viste en generel tendens til en stigning i styrke korrelerer med øget ring / kar størrelse. Ringe og fartøjer blev strakt periferisk. Parametre vurderes fra graferne var elasticitetsmodul, trækstyrke og fiasko styrke (angivet i tabel 1). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Cell såning nummer korrelation på såning surfeace-området. Baseret på humane aorta glatte muskelceller. Overfladearealet er defineret som området i ringdannelse plader mellem central stolpe og pladen væg eller ydre skal. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Six-ring fartøj underkastes perfusion analyse. A) Specialbyggede perfusion system til flow tests. B) Udviklet fartøj indlæst i perfusionssystemet. Tre fartøjer blev perfusion testet for lækager i op til 5 minutter under strømningsbetingelser. Skibene forblev stabile under flow, med mindre utæt på fartøjet endelige stik knyttet til slangesystemet. Klik her for at seen større version af denne figur.
Animeret Figur 1: Demonstration af perfusion strømning gennem et konstrueret fartøj. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
| Lille | Intermediate | Stor | |||||
| Ringe | Elasticitetsmodul (kPa) | 13,6 ± 2,25 | (N = 6) | 14,5 ± 1,2 | (N = 3) | 17,2 ± 2,2 | (N = 4) |
| Trækbrudstyrke (kPa) | 34,5 ± 10,2 | 39,6 ± 2,98 | 50,9 ± 10,6 | ||||
| Manglende Strength (kPa) | 34,5 ± 10,2 | 39,6 ± 2,98 | 50,9 ± 10,6 | ||||
| Fartøjer | Elasticitetsmodul (kPa) | 49,7 ± 2,80 | (N = 3) | 59.8 ± 3,90 | (N = 2) | 79,8 ± 10,1 | (N = 2) |
| Trækbrudstyrke (kPa) | 115 ± 6,90 | 137 ± 12,0 | 192 ± 86,9 | ||||
| Manglende Strength (kPa) | 96,2 ± 12,2 | 60,7 ± 12,1 | 173 ± 92,2 | ||||
Tabel 1: strækegenskaber de skalerede ringe og fartøjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
The Ring Stacking Method præsenterer flere fordele i forhold til de nuværende vaskulære manipuleret væv konstruere teknikker. RSM kan tilpasses at skabe menneskelige fartøjer af enhver størrelse ved blot at tilpasse post- og ydre shell dimensioner. Vores fremgangsmåde muliggør udvikling af polymer-fri manipulerede fartøjer udelukkende består af humane celler og hurtigt nedbrydelige bæremateriale findes i kroppens naturlige sårheling proces. Polymer transplantater er kendt for at forårsage restenose i klinikken og kunne blive problematisk hvis de er indeholdt i konstruerede transplantater. Cellepodning nummer skal ændres for hver forskellig størrelse væv ring. En graf af celletallet til såning overfladeareal er vist i figur 5, hvorfra seeding nummer kan approksimeres og / eller ekstrapoleret. Det skal bemærkes, at den anvendte celletype her er humane aorta glatmuskelceller. For at tilpasse RSM til forskellige celletyper, cellestørrelse og proliferationshastighed skal tages iovervejelse og optimal udsåningstæthed bestemt. For eksempel har vi også skabt human fibroblast ringe vha RSM, og har fundet, at mindst 2x er behov antallet af celler i forhold til SMC'er. Enhver ønsket længde af fartøjet kan bygges ved tilsætning af ringe. Ring stacks er blevet dyrket i op til 2 måneder og forblev stabil. Intermediate og store ringe er begge på det rette 1.500 um vægtykkelse selv om de hver konstrueret i en 60 mm og 100 mm plade, henholdsvis ved anbringelse af en ydre skal i 100 mm plade. Dette viser anvendeligheden af den ydre skal til styring og opnåelse af den passende vægtykkelse for et bestemt fartøj. I trin 3.3.1, tilsættes TGF-β1 fordi det er kendt for at stimulere produktionen af kollagen 19 og har den observerede effekt af stramning ringene. Når ringene er fuldstændigt rullet, er en dosis af TGF-β1 tilsættes i det sidste trin, og ringene er klar til brug 1 dag senere. TGF-β1 ikke forbedre kollagen produktionen i ringene, som set i Trichrome billeder (figur 2).
Celler i de små ringe er mere rund og kompakt, mens der i de 2 større størrelser celler langs yderkanterne vise en grad af tilpasning med vævet kant og sammen med andre tilpasset celler. Sidstnævnte kan indikere et senere tidspunkt i celle modenhed, udviklet sig fra højere indhold celle i større ringe, og dermed en større grad af intercellulær signalering til fremme modenhed. Fibringel interspersion i større ringe kan indikere, at større cellelag tendens til at folde lidt som de ruller. De histologiske billeder, der viser dette fænomen blev udtages 1 dag efter komplet ring roll op- det er således forståeligt, at fibrin gel, der tager 2 uger til at nedbrydes i kultur, stadig ville være til stede. Dyrkning ringene i mindst 2 uger bør forringe fibrin gel, efterlod en fuldt cellulær konstruktion.
nt "> Alpha-glatmuskelactin (SMA) udgør de tynde filamenter som letter sammentrækning og tropomyosin er et kontraktilt protein. 20, 21 Både SMA og tropomyosin var til stede i alle størrelser ringe, med den stærkeste, mest jævnt fordelt signal i det mellemliggende ringe. Dette fænomen kan skyldes en højere grad af celletæthed og organisation, stimulere en stigning i kontraktil operandi udvikling.Elasticitetsmodul angiver elasticiteten af ringene, og den stigende E fra små til store ringe antyder en øget kollagen og elastin produktion. Trækstyrke er den højeste styrke udholdt af ringene uden at bryde. Manglende styrke er det punkt af væv fiasko. For ringene, UTS lig FS. For de fartøjer, UTS er større end FS, som viser, at den endelige beholderens styrke tilskrives kombinationen af mekaniske bidrag fra alle ringenei beholderen, og den manglende punkt, fordi det svageste ring.
Styrken af vores manipuleret fartøjer lå i kPa rækkevidde, mens indfødte menneskelige skibe har styrker inden for MPa rækkevidde. For at styrke vores skibe mod at af indfødte fartøjer, undersøger vi teknikker til at øge ekstracellulære matrix produktion, nemlig af kollagen og elastin. Vækstfaktorer, der fremmer kollagen og elastin produktion er ved at blive påført på vores ringe at undersøge, om strækegenskaber vil stige.
Foruden mekaniske egenskaber, funktionelle målinger af muskelkontraktion er relevante for fartøjsydelse. Muskelstimulation og sammentrækning af faktorer såsom acetylcholin og epinephrin kan anvendes til at teste muskel kontraktile kraft. Sådanne eksperimenter er under overvejelse for vores fremtidige studier.
Samlet set viser vores resultater, at Ring Stacking fremgangsmåde kan let skaleresat opnå en række manipuleret karvæv størrelser. Skalering til de største menneskelige fartøjer, såsom 40 mm lumen aorta diameter, ville sandsynligvis kræve udviklingen af en vasa vasorum, mikrovaskulaturen naturligt til stede i store mellemstore fartøjer, som vores laboratorium er ved at udvikle. Desuden endothelcellelaget (dvs. intima), som typisk linier lumen medierne lag er vigtig for etablering af korrekt hæmodynamik i en beholder. Vores laboratorium arbejder i øjeblikket på oprettelsen af intima i vores SMC ring stack ved hjælp af humane vaskulære endotelceller. Med disse kombinerede teknologier, ville konstruerede fartøjer have større anvendelighed til klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke vores kollega Lam lab kolleger Ammar Chishti og Bijal Patel for deres venlige hjælp med nogle af histologi og cellekultur. Finansieringen blev leveret af Wayne State University Nanomedicin Fellowship (CBP), Start-Up fonde og Cardiovascular Research Institute Seed Grant (MTL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Aortic Smooth Muscle Cells | ATCC | PCS-100-012 | vascular smooth muscle cells |
| Medium 231 | Gibco (Life Technologies | M-231-500 | media specific to vascular smooth muscle cells |
| Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PSC-100-042 | growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability |
| Replicator Mini 3D printer | MakerBot | N/A | 3D printer |
| Poly(lactic acid) 3D ink (PLA) | MakerBot | N/A | 3D printer filament |
| Poly(dimethlysiloxane) (PDMS) | Ellworth Adhesives | 3097358-1004 | polymer for gluing plate parts |
| Fibrinogen | Hyclone Labratories, Inc. | SH30256.01 | fibrin gel component |
| Thrombin | Sigma Life Sciences | F3879-5G | fibrin gel component |
| Tranforming Growth Factor-Beta 1 | PeproTech | 100-21 | growth factor for stimulating collagen production |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | for cell counting |
| Polycarbonate tubing | US Plastics | PCTUB1.750X1.625 | material for making tall, ring stacking plates |
| Polycarbonate sheet | Home Depot | 409497 | material for making tall, ring stacking plates |
| Adhesive polymer solvent | SCIGRIP | 10799 | material for making tall, ring stacking plates |
| Instron 5940 | Instron | N/A | tensile testing machine |
| U-Stretch | Cell Scale | N/A | tensile testing machine |
| Smooth Muscle Actin | MA5-11547 | Thermo Fisher | antibody |
| Tropomyosin | MA5-11783 | Thermo Fisher | antibody |
References
- Luciani, G. B., et al. Operative risk and outcome of surgery in adults with congenital valve disease. ASAIO J. 54 (5), 458-462 (2008).
- Lawson, J. H., et al. Bioengineered human acellular vessels for dialysis access in patients with end-stage renal disease: two phase 2 single-arm trials. Lancet. 14 (387), 2026-2034 (2016).
- McAllister, T. N., et al. Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study. Lancet. 373 (9673), 1440-1446 (2009).
- Wystrychowski, W., et al. First human use of an allogeneic tissue-engineered vascular graft for hemodialysis access. J Vasc Surg. 60 (5), 1353-1357 (2014).
- Konig, G., et al. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30 (8), 1542-1550 (2009).
- Gui, L., et al. Construction of tissue-engineered small-diameter vascular grafts in fibrin scaffolds in 30 days. Tissue Eng Part A. 20 (9-10), 1499-1507 (2014).
- Sundaram, S., Echter, A., Sivarapatna, A., Qiu, C., Niklason, L. Small-diameter vascular graft engineered using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells. Tissue Eng Part A. 20 (3-4), 740-750 (2014).
- Quint, C., Arief, M., Muto, A., Dardik, A., Niklason, L. E. Allogeneic human tissue-engineered blood vessel. J Vasc Surg. 55 (3), 790-798 (2012).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 31 (108), 9214-9219 (2011).
- Dahl, S. L., et al. Readily available tissue-engineered vascular grafts. Sci Transl Med. 2 (68), (2011).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Meier, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells alter remodeling of completely biological engineered grafts implanted into the sheep femoral artery. J Cardiovasc Transl Res. 7 (2), 242-249 (2014).
- Pinnock, C. B., Meier, E. M., Joshi, N. N., Wu, B., Lam, M. T. Customizable engineered blood vessels using 3D printed inserts. Methods. S1046-2023 (15), 30184-30185 (2015).
- Blakely, A. M., Manning, K. L., Tripathi, A., Morgan, J. R. Bio-Pick, Place,and Perfuse: A New Instrument for Three-Dimensional Tissue Engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (7), 737-746 (2015).
- Gwyther, T. A., et al. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).
- Fearon, W. F., et al. Changes in coronary arterial dimensions early after cardiac transplantation. Transplantation. 27 (6), 700-705 (2007).
- Erbel, R., Eggebrecht, H. Aortic dimensions and the risk of dissection. Heart. 92 (1), 137-142 (2006).
- Ha, D. M., et al. Transforming growth factor-beta 1 produced by vascular smooth muscle cells predicts fibrosis in the gastrocnemius of patients with peripheral artery disease. J Transl Med. 14, 39 (2016).
- Skalli, O., et al. Alpha-smooth muscle actin, a differentiation marker of smooth muscle cells, is present in microfilamentous bundles of pericytes. J Histochem Cytochem. 37 (3), 315-321 (1989).
- von der Ecken, J., et al. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
