Summary
Ölçeklenebilir mühendislik kan damarları klinik uygulanabilirliğini artıracaktır. Kolayca büyükçe 3D baskılı kılavuzları kullanarak, damar düz kas halkaları oluşturulan ve bir damar grefti oluşturan, boru şeklinde bir forma yığılmış. Greftler sadece 3D baskılı kılavuz boyutunu değiştirerek insan koroner arter boyutları aralığını karşılamak için büyüklükte olabilir.
Abstract
Koroner arter hastalığı milyonlarca Amerikalıya etki, ölüm önde gelen nedenidir. Mevcut otolog vasküler greft eksikliği ile mühendislik greftler hasta tedavisi için büyük bir potansiyel sunmaktadır. Ancak, mühendislik vasküler greftler genellikle kolayca ölçeklenebilir değildir, bir zaman alıcı ve masraflı uygulama oluşturan, farklı boyutlarda özelleştirmek için özel kalıplar veya polimer tüplerin imalatını gerektirir. İnsan arterler yaklaşık 2,0-38 mm ve yaklaşık 0.5-2.5 mm et kalınlığında lümen çapı değişir. Biz bir yöntem yarattık, istenilen hücre tipi doku değişken boyutu yüzük, damar düz kas hücreleri ile Burada gösterilen hangi "Halka İstifleme Metodu," (SMC'lere) olarak adlandırılan, lümen çapı kontrol etmek için merkez mesajların kılavuzları kullanılarak oluşturulabilir ve dış kabukları damar duvar kalınlığı dikte etmek. Bu doku halkaları, sonra bir kan damarının doğal formunu taklit eden, boru şeklinde bir yapı oluşturmak için dizilir. damar uzunluğu olabilir be sadece gerekli uzunlukta teşkil gereken çalma sayısını istifleme uyarlanmış. Bu teknik ile, bir kan damarı benzer boru şeklinde, dokular kolaylıkla klinik ve hastanın gereksinimlerini karşılamak için boyut ve uzunlukları çeşitli imal edilebilir.
Introduction
koroner arter hastalığının (CAD) tedavisinde, hastanın kendi kan damarları bypass greft malzeme olarak toplanır. Ancak, çoğu zaman, hastalar kendilerine bağış uygulanabilir damarları yoktur ve yaptıkları durumlarda, donör saha hatırı sayılır ek zarar ve enfeksiyon için ciddi bir risk vardır. 1 Engineered vasküler greft bu ihtiyacı doldurmak olabilir. Ölçeklenebilirlik hasta damar boyutu gereksinimleri geniş karşılamak amacıyla mühendislik gemiler için büyük önem taşımaktadır. Ancak, mühendislik gemiler için mevcut yöntemler kolayca ölçeklenebilir değildir ve genellikle karmaşık kalıp ya da polimer iskelelerinin yeniden üretmeyin gerektirir. En greft vasküler fibroblastlar, düz kas, veya endotelyal hücre tohumlanır bir polimer boru şekilli iskele kullanılması da tasarlanmıştır; veya bir mandrel etrafında bir hücre tabakasını haddeleme bir doku tüpü oluşturmak için. Klinik çalışmalarda iki tasarlanmış vasküler greftler decellularize dayanmaktadırd polimer ECM platformu. Vasküler tedavisinde kullanılmak için uygun, 2, 3, 4 Polimer greft önce sürekli bir polimer mevcudiyetinde, bir aşı uzun süreli uygulaması ile önemli bir sorun olarak ortaya çıkabilecek açıklık ile ilgili sorunlar, sahip oldukları bilinmektedir. Boru kalıplar işlemleri çeşitli boyutlarda gemileri üretmek için özel kalıplar için ek bir tasarım ve takım imalat gerektirmektedir 13 olan tam hücresel damarları, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, imal etmek için kullanılmıştır .
Burada açıklanan yöntem kolayca ölçeklenebilir mühendislik vasküler oluşturmak için yeni bir teknik kapsarözelleştirilebilir 3D baskılı ekler ve geleneksel kültür plakaları kullanılarak greft. 14 Hücreler merkezi bir mesaj ve dış kabuk ekler ile levhaları içerisine ekilirler. son kontroller çapı lümen ve hücre tek tabaka dokusunun bir halka içine kendini monte sağlar. dış halka kabuk kontrolleri kalınlığı ve son geminin böylece duvar kalınlığı. Tamamlanan doku halkaları daha sonra bir boru şeklinde, damar greft oluşturmak üzere dizilir. Bu yöntemin avantajı, "halkası İstifleme Yöntemi" olarak adlandırılan bir yapışık hücre tipi, basit değiştirme kılavuzu uçlar ile üretilebilir bir plaka ortamında ve doku halkaları ya da arzu edilen bir uygulama için gerekli olan herhangi bir boyut tüplere tohumlanır edilebilmesidir. Doku doku mühendisliği yaratma halkaları Karşılaştırmalı teknikler istenen her boyutu için kalıpların yeniden üretmeyin gerektiren ölçek, 15, 16 zor kalır. Buna ek olarak, vasküler greft elde edilebilir, bu yöntem kullanılarak yapılabilecek2-3 hafta içinde d birkaç hafta daha hızlı diğer mühendislik gemilere oranla. 6 klinikte için, bu kez fark bir kötüleşen hastanın tedavisinde önemli bir fark yaratabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre kültürü preparasyonu
- ticari olarak satın alınan insan aortik düz kas hücreleri kullanmaktadır.
- % 88,6 oluşan düz kas hücresi büyüme ortamı içinde hücreleri korumak 231 ortam,% 0.1, rekombinant insan insülini (rh-insülin), rekombinant insan fibroblast büyüme faktörü (rh-FGF), rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (rh-FGF) her biri, ve askorbik asit; ve% 5 fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ve L-glutamin, her; ve% 1 antibiyotik / antimikotik.
NOT: Her büyüme faktörü, FBS ve L-glutamin vasküler medya büyüme kit olarak satın alınır. - Değişim Medya hücrelere kadar her 48 saatte yaklaşık% 90 konfluent ve doku ekimi için hazır.
- genişleme ortam değişiklikleri ile bir kuluçka makinesi içinde deposu hücreleri.
2. 3D Baskılı Ekler ve Özel Silikon hazırlanması kalıplı Tabaklar
- (Örneğin, Replicator Mini) 3D için plaka ekler baskı ticari bir 3D yazıcı kullanın.
- op kullanınkaynak 3 boyutlu tasarım yazılımı tr gibi Blender olarak basılan dış kabukları ve mesajların 3D modeller oluşturmak.
- 3D yazıcının yazılımı taşınabilirlik için izin veren bir stl formatında yoluyla modelin sürücü dosyasını dışa aktarın.
- 3D yazıcıya yüklenen poli kullanılarak yazdırılan mesajları ve dış kabukları (laktik asit) filaman (PLA) üretin.
- baskı takiben, 30 dakikalık her insert sterilize etmek% 70 -100% etanol çözeltisi içinde ıslatın gerçekleştirin.
- poli (dimetilsiloksan) polimer karışımının (PDMS), silikon polimer taban ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında gaz çıkışına izin vermek için karışım 1:10 sertleştirme ajanı hazırlanır.
- petri küçük (35 mm) olarak kullanılır boyutları (60 mm), orta ve büyük (100 mm) tanımlar.
- 2 mL, 4 mL ve sırasıyla küçük, orta ve büyük plakaya vulkanize silikon 6 mL ekleyin ve bir petri tüm alt kısmında ince bir tabaka oluşturur.
- Bir içine PDMS dökerek küçük bir tabak için mesajları oluşturun7 mm'lik bir yüksekliğe 100 mm levha ve yaklaşık 2-3 saat boyunca 60 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde tedavi sağlar. Sonra silindirik Mesajları dışarı yumruk 5 mm'lik biyopsi yumruk kullanın. Her bir silindir PDMS ve her bir küçük plaka merkezine sabitlemek için vulkanize edilmemiş PDMS az miktarda kullanın.
- orta ve büyük tabak için önce, plakanın altındaki PDMS kürünü tamamlayan 3D baskılı mesaj sırasıyla 10 mm ve merkezi her orta ve büyük tabak içine çapı 20 mm, yerleştirmek için. Büyük plakaları için, ayrıca 3D baskılı dış Kabuğu görevinden çap equidistance yaklaşık 66.7 mm yerleştirin.
- Her bir tabak, polimerin Gaz çıkışı için 18 saat bırakılarak, yaklaşık 2-3 saat boyunca 60 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde, açık havada bekletilmelidir. Şekil 1 'de görüldüğü gibi, uygun bir bölge ve yönlendirme plakaya baskılı bileşenleri düzeltildi.
- Tüm PLA içine 30 dakika süre ile% 30 distile su ile,% 70 etanol içeren bir çözelti eklemesonra sterilizasyon için tes ve her plaka kapsar.
- Dikkatle her plaka etanol aspirat ve kurumaya bırakın.
- onun kapağı, yüz-up yanında biyolojik güvenlik kabini (BSC) her plakayı düzenleyin. sterilizasyon tamamlamak için 30 dakika boyunca BSC altında, UV ışığına tabak ve kapak Açığa. Steril teknik UV ışınlarına maruz kalan her adım ile yapılır.
Düz kas hücreleri ve Plakaların Bakım ile tohumlama Fibrin Hidrojel 3. hazırlanması,
- sırasıyla, küçük, orta ve büyük plaka boyutları için 0.5 mL, 1.1 mL 1.81 mL miktarlarda büyüme ortamı +% 0.01, TGF-ß1 ihtiva fibrin jel ihtiva eden bir çözelti karıştırın.
- sırasıyla, her küçük, orta ve büyük bir tabak ortama, 100 U / mL bir stok, 40 uL, 88.4 ul trombin 145 uL ekleyin. Yavaşça o trombin eşit medya içinde karıştırılır sağlamak için elle her plaka girdap.
- Sonraki, 160 eklemek1; 20 mg, bir stok L 354 uL ve 580 uL fibrinojen / ml, damla damla dairesel trombin ortam karışımı, her bir küçük, orta ve büyük plaka, sırasıyla. Yavaşça düz bir tabaka haline karıştırma ve hidrojel dağılımı sağlamak için elle girdap.
- hidrojel, oda sıcaklığında 10-15 dakika bekletilmelidir.
- Trypsinize düz kas hücreleri, standart protokollere göre, 150 mm'lik bir hücre kültür plakaları ve santrifüj içinde genişletildi. 231 ortam,% 1 FBS ve% 1 antibiyotik / antimikotik - Elde edilen topak% 98 aşağıdakilerden oluşan farklılaşma medya 3 mL içinde yeniden süspansiyon haline edilmelidir.
- Şiddetle herhangi bir hücre kümeleri kırmak için 2 ml pipet ile titre ve aşağı hücreleri karıştırın. Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve / ml, küçük, orta ve büyük plakalar ile, sırası ile, 2 x 10 6 hücre / mL, 1.0 x 10 7 hücre / ml ile 1.4 x 10 7 hücre, bir hücre süspansiyonu elde.
- Her bir hücre süspansiyonu int 1 ml ekleyinoa 50 ml konik karşılık, küçük, orta ve büyük etiketli. İstenen her ek doku halka için bu şekilde ilave bir 50 ml konik ayarlayın.
- sırasıyla, her küçük, orta ve büyük gemi için 2 mL, 4 mL, 5 mL nihai tohumlama hacimleri için, her konik farklılaşma ortam ekleyin. Sonra, dikkatle damla damla her gelen plaka Hazırlanan hidrojel üstüne hücre çözümü pipetlemeyin.
- 37 ° C'de kuluçka% 5 CO2 içinde yer plakalar.
- Değişim farklılaşma medya her plaka için her 48-72 saat. daha büyük bir plaka halinde, o zaman, ilk olarak, 24 saat sonra ortam değiştirme büyük hücreli tohum ekme yoğunluğu telafi etmek için bunu her 48-24 saatte bir değiştirin.
- halkaları gibi 2-4 gün tümüyle yazılan doğru daralan olacak sonra, sırasıyla, her küçük, orta ve büyük bir halka 10 uL, 20 uL ve TGF-ß1 35 ul ekle. TGF-p maruz bırakıldıktan sonra1; en az 24 saat süre ile, halka ele hazırdır.
Vasküler Construct ve Bakım 4. Meclis
- Nihai vasküler yapı imalatı önce özel bir kap tamamlanmış gemi tutmak için oluşturulur.
- Küçük gemi için, 50 ml polikarbonat konik tüp üst kapalı 2-inç bölümünü keserek halka istifleme için uzun boylu bir tabak oluşturun ve sonra PDMS 35 mm tabak içine kesme kenarı tutkal. plaka kapak olarak konik kapağı kullanın.
- plakaları istifleme orta ve büyük damar uzun ring, uzunlamasına uzun plaka duvarları olarak hizmet 2.5 inç bölüme 1.75-inç çaplı polikarbonat tüp kesti. uzun boylu plaka dipleri için, 2-inç çaplı daire parçalar halinde 0.125 inç kalınlığında polikarbonat levha kesti. Akrilik çözücü çimento kullanarak, dairesel kesme parçasına polikarbonat tüp bölümü bağlarlar. uzun boylu plaka için kapaklı olarak 60 mm petri kapağını kullanın.
- 3D pRint mesaj 5, çapı 10 mm ve 20 mm uzunluğunda ve 50 mm.
- Her kaba sertleştirilmemiş silikon 10 ml ekleyin. Önceki PDMS tam kür merkezi her küçük, orta ve büyük kabın içine adım 4.1.3 oluşturulan her yazı yerleştirin.
- 2-3 saat boyunca 60 ° C'ye kadar bir sıcak plaka kümesi bekletilmelidir.
- 30 dakika boyunca% 30 distile su ile,% 70 etanol içindeki bir çözeltisi ile sterilize edin.
- Dikkatle her konteyner etanol aspirat ve sonra BSC kurumaya bırakın. Sonra, onun kapağı, yüz-up yanına yerleştirilen her plaka ile kaputun kapları düzenlemek. daha sterilizasyon için 30 dakika daha BSC altında UV ışığı konteyner Açığa. UV ışınlarına maruz kalan her adımda steril tekniği kullanın.
- Çok ince forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde yazılan her sıkıca rulo düz kas hidrojel halkasını çıkarın ve uzun boylu mesajlar ile karşılık gelen büyük kabına aktarın.
- bir çift kullanınher el forseps ve görevinden halka bir tarafı kaldırın ve daha sonra diğer. korumak ve lümen korumak için dikkatli olun.
- uzun boylu yazılan üzerine ilk bir tarafı, halka sonra diğer tarafını sürgülü, bu iki elle yöntemi ile transferi gerçekleştirin. nazik, kademeli hareketleri kullanarak, ve çevresel çalışma, yavaş yavaş uzun yazı üzerine aşağı halka itin. İstenen damar uzunluğu ve her bir halka tamamlanmış yapısına uzunluğunun yaklaşık 1-2 mm ekleyerek elde edilene kadar sonra, doku halkaları yığını.
- sonrası çalışma yüzeyi ile paralel olacak şekilde uzun boylu 3D baskılı yazılarda konumlandırılmış halka yığını ile, plaka çevirin.
- Mikropipet kullanılarak, sırasıyla, her küçük, orta ve büyük bir geminin dış yüzeyine hafifçe 100 U / ml bir konsantrasyonda trombinin 40, 80 ve 160 uL ilave edin. trombin eklerken, yavaş yavaş yapısının tüm yüzeylerin kapsama bile emin olmak için plakayı döndürün.Bu inşaat sonrası ilk günlerde halka yığını yapı güvenliğini sağlamak için kullanılan fibrin yapıştırıcı için üs olacak.
- Daha sonra, hızlı bir şekilde yapı dönerken bir mikropipet kullanılarak, sırasıyla, her küçük, orta ve büyük yapısına 20 mg / mL'lik bir konsantrasyonda fibrinojen 40, 80 ve 160 uL ilave edin. Trombin ve fibrinojen hızla kez karışık bir firma jele ayarlayın. Nedeniyle kısa sertleşme süresi, mümkün olduğu kadar çabuk ve eşit fibrinojen uygulayın.
- yapıyı tutan her kaba farklılaşma medya 20 mL ekleyin. 37 ° C inkübatör içine yerleştirin damarları kadar gerekli. Her 3-5 gün medya değiştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada gösterilen Halka İstifleme Yöntemi (RSM) ölçeklenebilir olduğunu gösteren, 3 farklı mühendislik damar greft boyutları (Şekil 1) uydurma. Uygulanabilirliğini ispat etmek için, 3 farklı damar boyutları sol ön inen arter için gerçek insan damar boyutuna korelasyonu seçilmiş (küçük; çaplı lümen = 4 mm) 17 (orta; çap lümen = 10 mm) inen aorta ve çıkan aort (büyük; lümen çapı = 20 mm) 18. Duvar kalınlığı yaklaşık 500 mikron küçük halkalar için, hem de orta ve büyük halkalar için yaklaşık 1.500 mikron olduğunu. Uygulanan her kap küçük bir gemi için, yaklaşık 6 mm ve orta ve büyük gemiler için 9 mm'lik bir uzunluğa denk, 6 yüzük istifleme ile yapılmıştır. Uzunluk, her bir halka duvar kalınlığına bağlıdır.
ortaya histolojik analiztüm halkaları boyutlarda yüksek sellüler (Şekil 2). Kırmızı Malzeme Fibrin jel çizmektedir. Küçük halkalardaki tortusal fibrin jel bir miktar halkanın dış kenarında görülür. Daha büyük halkalar, bazı fibrin jel hücresel içeriği ile serpiştirilmiş edildi. Masson trikrom boyası olarak, (mavi ile işaretlenmiş) kollajen üretiminin endikasyonlar, orta ve büyük halkalar görülebilir.
Antikorlar a-düz için kas aktini (SMA) ve tropomiyozin (Şekil 3) halka oluşumu aşağıdaki hücre fenotipi belirlemek için, doku halkaları immünofloresan kullanılarak analiz edildi. Tüm halka boyutları düz kas fenotip devam edildi doğrulayarak, her iki antikor pozitiftir.
Çekme testi mekanik özellikleri (Şekil 4) tespit için farklı boyutlu halkaları üzerinde gerçekleştirilmiştir. U-streç, bir mekanizmalbir Instron çekme deneyi, büyük halkalar ve kaplara kullanılırken CAL test cihazı, test Küçük ve orta halka ve damarları gerilme için kullanılmıştır. Elastik modülü (E), nihai çekme mukavemeti (UTS) ve kırılma direnci (FS) verileri elde edilmiştir. Istikrarlı bir trend artan halka ve damar boyutuna korele gücünü artırmak gözlenmiştir.
Çeşitli büyüklükteki halkaları oluşturmak için gerekli sayı tohum hücre tohumlama yüzey alanı (Şekil 5) ile yaklaşık doğrusal olarak artmıştır. Daha büyük halkalar oluşturmak için, en az 14 milyon hücre abdominal aorta büyüklüğünde halkaları oluşturmak için gerekli bulundu.
Altı halkalı yığınları ya da kaplar, akış dayanma kabiliyetleri açısından test edildi. Konstruktlar özel yapılmış bir perfüzyon sistemine (Şekil 6) içine yüklenmekte ve 100 417 ml / dakika akış hızlarında en fazla 5 dakika akış tabi tutuldu. Gemiler vardıakışını dayanabilmesi. Küçük sızıntı perfüzyon sistemine konnektör, gemi uçlarında gözlenmiştir.
Şekil 1: ölçekli mühendislik gemilerin inşaatı. , Işlenmiş damarları ölçekleme plaka hazırlanması, hücre tohumlama ve kap yapı ile başlangıç sürecinin A) diyagramı. Üç farklı boyutta B) halkaları ve C) gemiler gösterdi vardır. D) Temsilci büyük damar tamamen biyolojik ve doğal dokusunu andırmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Histolojik analiz. Rong> H & E ve Masson Trikrom lekeler tüm halka boyutları için halka kalınlığı boyunca canlı selülarite göstermektedir. Trikrom lekeleri mavi (mavi oklar) ile belirtilen kollajen üretiminin alanlarını ortaya koymaktadır. Büyük halkalar fibrin jel nedeniyle hücre tabakasının nispeten daha büyük yüzey alanının katlanmasının, muhtemel serpiştirilmiş gösterdi. Ölçek çubukları: küçük halkalar = 200 mikron; ara halkalar = 200 mikron; ve büyük halkalar = 0.5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: düz kas belirteçleri için Immunoflorasan analizi. Tüm halka boyutları düz kas kontraktil proteinlerin α-düz kas aktini (SMA) ve tropomiyozin (Tm) pozitif bulunmuştur. Ölçek çubukları 200 mikron =.yük / 55322 / 55322fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Çekme deneyi analizi. yüzük ve gemilerin tüm boyutları için gerilme-uzama eğrileri, halka / damar boyutu artışla ilişkilendirerek direncinde artışa genel eğilim gösterdi. Halkalar ve gemiler çevresel gerildi. Grafiklerden değerlendirilen parametreler elastik modülü, nihai çekme dayanımı ve kırılma mukavemeti (Tablo 1 'de listelenmiştir) idi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Hücre ekim sörf sayı korelasyon tohumlamaace alanı. İnsan aortik yumuşak kas hücrelerinde dayanmaktadır. yüzey alanı merkezi mesaj ve plaka duvarı veya dış kabuk arasındaki halka oluşumu plakalarda alan olarak tanımlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: perfüzyon analizine tabi Altı halka gemi. Akış testi için A) Özel oluşturulmuş perfüzyon sistemi. Perfüzyon sistemine yüklenen B) Engineered gemi. Üç gemi perfüzyon akış koşulları altında en fazla 5 dakika boyunca sızıntı olup olmadığı kontrol edilmiştir. gemiler sistem tüp takılı damar uç konnektörleri minör sızıntı ile, akış altında stabil kaldı. Görmek için buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Hareketli Resim 1: Bir mühendislik damar yoluyla perfüzyon akışının gösterilmesi. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)
| Küçük | Orta düzey | Geniş | |||||
| Yüzükler | Esneme modülü (kPa) | 13.6 ± 2.25 | (N = 6) | 14.5 ± 1.2 | (N = 3) | 17.2 ± 2.2 | (N = 4) |
| Nihai Çekme Dayanımı (kPa) | 34.5 ± 10.2 | 39.6 ± 2.98 | 50.9 ± 10.6 | ||||
| Başarısızlık Gücü (kPa) | 34.5 ± 10.2 | 39.6 ± 2.98 | 50.9 ± 10.6 | ||||
| Gemiler | Esneme modülü (kPa) | 49.7 ± 2.80 | (N = 3) | 59.8 ± 3.90 | (N = 2) | 79.8 ± 10.1 | (N = 2) |
| Nihai Çekme Mukavemeti (kPa) | 115 ± 6.90 | 137 ± 12.0 | 192 ± 86.9 | ||||
| Başarısızlık Gücü (kPa) | 96.2 ± 12.2 | 60.7 ± 12.1 | 173 ± 92,2 | ||||
Tablo 1: ölçekli halkalar ve gemilerin çekme özellikleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Halka İstifleme Metodu mevcut vasküler doku mühendisliği yapı teknikleri üzerinde birden fazla avantaj sunuyor. RSM sadece yazılan ve dış kabuk boyutları özelleştirerek her boyutta insan damarları oluşturmak için adapte edilebilir. Bizim yöntemi, yalnızca insan hücreleri ve hızla vücudun doğal yara iyileşme sürecine bulundu destek malzemesi aşağılayıcı oluşan polimer serbest mühendislik damarların gelişimi için izin verir. Polimer greft klinikte restenoz neden olduğu bilinmektedir ve mühendislik greft içerdiği takdirde sorun haline gelebilir. Hücre tohumlama sayısı her farklı boyut doku halkası için değiştirilmesi gerekiyor. Tohumlama yüzey alanı, hücre sayısını içeren bir grafik Şekil 5'te gösterilen edildiği tohumlama sayısı yaklaşık olarak ve / veya tahmin edilebilir. Burada kullanılan hücre tipi, insan aortik düz kas hücreleri olduğu not edilmelidir. Farklı hücre tipleri için RSM uyum için, hücre boyutunu ve proliferasyon hızı alınması gerekirgöz ve optimal tohum yoğunluğu belirlendi. Örneğin, daha da RSM kullanılarak insan fibroblast halkaları oluşturduk ve en az hücrelerin sayısı SMC'leri göre gerekli olan 2x bulmuşlardır. teknenin istenen herhangi bir uzunlukta halkaları eklenmesiyle oluşturulabilir. Halka yığınları kadar 2 ay boyunca kültüre ve sabit kalmıştır edilmiştir. Orta ve büyük halkalar her ikisi de, her 100 mm levha bir dış kabuğun yerleştirilmesi ile, sırası ile, 60 mm ve 100 mm tabak içinde inşa edilir halde uygun 1.500 mikron duvar kalınlığına tutulur. Bu kontrol ve belirli bir kap için uygun duvar kalınlığı elde etmek için dış kabuğun yarar göstermektedir. Kolajen üretimini stimüle ettiği bilinen 19 ve halka sıkma gözlenen etkiye sahip olduğu için Aşama 3.3.1, TGF-β1 ilave edilir. halkaları, haddelenmiş sonra, TGF-ß1 bir doz son aşamada eklenmektedir, ve halkalar, daha sonra kullanımdan önce 1 gün için hazırdır. TGF-β1 Trichrome görüntüleri (Şekil 2) görüldüğü gibi, halkalar kollajen üretimini artırmak yapar.
2 büyük boyutlarda, dış kenarları boyunca hücreler doku kenarı ile ve diğer uyumlu hücreleri ile birlikte uyum derecesi görüntüler ise küçük halkalarda hücreler, daha yuvarlak ve kompakt. ikincisi daha büyük halkalar yüksek hücre içeriği gelişti hücre olgunluk sonraki bir aşamaya işaret edebilir ve bu nedenle içi sinyalizasyon daha büyük bir derecesi olgunluk teşvik etmek. Büyük halkalar fibrin jel sülün büyük hücre sayfaları onlar rulo hafifçe kat eğiliminde olduğunu gösteriyor olabilir. Bu olguyu gösteren histolojik görüntüleri yukarı böylece tam bir halka rulo o kültürde düşmeye 2 hafta sürer fibrin jel, hala mevcut olacağını anlaşılabilir aşağıdaki 1 gün alındı. en az 2 hafta boyunca halkalar Kültürleme tamamen hücresel yapı geride bırakarak, fibrin jel aşağılamak gerekir.
nt "> Alfa-düz kas aktini (SMA) daralma ve tropomiyozin bir kasılma protein kolaylaştırmak ince filamentleri oluşturmaktadır. 20, 21 SMA ve tropomiyozin Hem orta güçlü, en dağılmış sinyali ile, tüm boyut halkaları mevcuttu yüzük. Bu olgu kasılma operandi gelişiminde bir artış uyarıcı, hücre yoğunluğu ve organizasyon daha yüksek bir derecede bağlı olabilir.Elastik modülü halkaların esnekliğinin belirtir ve büyük halkalar küçük artan e kolajen ve elastin üretiminde bir artış göstermektedir. Nihai çekme mukavemeti bozmadan halkalar katlandığı yüksek gücüdür. Başarısızlık gücü doku başarısızlık noktasıdır. halkalar için, UTS FS eşittir. gemiler için, UTS geminin nihai dayanım tüm halkaları mekanik katkı kombinasyonu atfedilen olduğunu gösteren, FS büyüktürbir kap içinde, ve arıza noktası en zayıf halka kaynaklanmaktadır.
doğal insan gemiler MPa aralığında güçlü sahipken bizim mühendislik gemilerin gücü, kPa aralığında yatıyordu. yerli gemilerin bu doğru bizim gemileri güçlendirmek amacıyla, biz hücre dışı matriks üretimini, yani o kolajen ve elastin artırmak için teknikleri araştırıyoruz. kolajen ve elastin üretimini teşvik Büyüme faktörleri şu anda gerilme özellikleri artacak olup olmadığını araştırmak için halkalara uygulanmaktadır.
Mekanik özelliklere ek olarak, kas kasılması fonksiyonel taşıma aracı performans ile ilgili bulunmaktadır. asetilkolin ve epinefrin gibi faktörlerden kas uyarımı ve daralma kas kasılma kuvveti test etmek için de kullanılabilir. Bu tür deneyler gelecekteki çalışmalar için kabul edilmektedir.
Genel olarak, bizim sonuçlarımız Halka İstifleme Metodu kolayca ölçeklendirilebilir göstermektedirmühendislik vasküler doku boyutları bir dizi elde etmek. Böyle çap aort lümen 40 mm olarak en büyük insan damarları, ölçekleme, büyük olasılıkla laboratuar şu anda gelişmekte olan bir Vasa vasorum'daki, büyük boyutlu gemiler içinde doğal olarak bulunan mikrovasküler, geliştirilmesi gerekir. Buna ek olarak, medya tabakasının lümen bir kap içinde uygun hemodinaminin kurulması için önemli olan, tipik çizgiler endotel hücre tabakası (yani, intima). Bizim laboratuvar şu anda insan vasküler endotelyal hücreler kullanarak SMC halka yığınında intima oluşturulması üzerinde çalışıyor. Bu kombine teknolojiler sayesinde, mühendislik gemiler kliniğe daha uygulanabilirliği olurdu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar histoloji ve hücre kültürü ile bazı kendi tür yardım için adam Lam laboratuvar meslektaşları Ammar Çişti ve Bijal Patel teşekkür etmek istiyorum. Fonlama Wayne State University Nanotıp Bursu (CBP) tarafından sağlandı, Start-Up Fonlar ve Kardiyovasküler Araştırma Enstitüsü Tohum Hibe (MTL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Aortic Smooth Muscle Cells | ATCC | PCS-100-012 | vascular smooth muscle cells |
| Medium 231 | Gibco (Life Technologies | M-231-500 | media specific to vascular smooth muscle cells |
| Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PSC-100-042 | growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability |
| Replicator Mini 3D printer | MakerBot | N/A | 3D printer |
| Poly(lactic acid) 3D ink (PLA) | MakerBot | N/A | 3D printer filament |
| Poly(dimethlysiloxane) (PDMS) | Ellworth Adhesives | 3097358-1004 | polymer for gluing plate parts |
| Fibrinogen | Hyclone Labratories, Inc. | SH30256.01 | fibrin gel component |
| Thrombin | Sigma Life Sciences | F3879-5G | fibrin gel component |
| Tranforming Growth Factor-Beta 1 | PeproTech | 100-21 | growth factor for stimulating collagen production |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | for cell counting |
| Polycarbonate tubing | US Plastics | PCTUB1.750X1.625 | material for making tall, ring stacking plates |
| Polycarbonate sheet | Home Depot | 409497 | material for making tall, ring stacking plates |
| Adhesive polymer solvent | SCIGRIP | 10799 | material for making tall, ring stacking plates |
| Instron 5940 | Instron | N/A | tensile testing machine |
| U-Stretch | Cell Scale | N/A | tensile testing machine |
| Smooth Muscle Actin | MA5-11547 | Thermo Fisher | antibody |
| Tropomyosin | MA5-11783 | Thermo Fisher | antibody |
References
- Luciani, G. B., et al. Operative risk and outcome of surgery in adults with congenital valve disease. ASAIO J. 54 (5), 458-462 (2008).
- Lawson, J. H., et al. Bioengineered human acellular vessels for dialysis access in patients with end-stage renal disease: two phase 2 single-arm trials. Lancet. 14 (387), 2026-2034 (2016).
- McAllister, T. N., et al. Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study. Lancet. 373 (9673), 1440-1446 (2009).
- Wystrychowski, W., et al. First human use of an allogeneic tissue-engineered vascular graft for hemodialysis access. J Vasc Surg. 60 (5), 1353-1357 (2014).
- Konig, G., et al. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30 (8), 1542-1550 (2009).
- Gui, L., et al. Construction of tissue-engineered small-diameter vascular grafts in fibrin scaffolds in 30 days. Tissue Eng Part A. 20 (9-10), 1499-1507 (2014).
- Sundaram, S., Echter, A., Sivarapatna, A., Qiu, C., Niklason, L. Small-diameter vascular graft engineered using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells. Tissue Eng Part A. 20 (3-4), 740-750 (2014).
- Quint, C., Arief, M., Muto, A., Dardik, A., Niklason, L. E. Allogeneic human tissue-engineered blood vessel. J Vasc Surg. 55 (3), 790-798 (2012).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 31 (108), 9214-9219 (2011).
- Dahl, S. L., et al. Readily available tissue-engineered vascular grafts. Sci Transl Med. 2 (68), (2011).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Meier, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells alter remodeling of completely biological engineered grafts implanted into the sheep femoral artery. J Cardiovasc Transl Res. 7 (2), 242-249 (2014).
- Pinnock, C. B., Meier, E. M., Joshi, N. N., Wu, B., Lam, M. T. Customizable engineered blood vessels using 3D printed inserts. Methods. S1046-2023 (15), 30184-30185 (2015).
- Blakely, A. M., Manning, K. L., Tripathi, A., Morgan, J. R. Bio-Pick, Place,and Perfuse: A New Instrument for Three-Dimensional Tissue Engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (7), 737-746 (2015).
- Gwyther, T. A., et al. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).
- Fearon, W. F., et al. Changes in coronary arterial dimensions early after cardiac transplantation. Transplantation. 27 (6), 700-705 (2007).
- Erbel, R., Eggebrecht, H. Aortic dimensions and the risk of dissection. Heart. 92 (1), 137-142 (2006).
- Ha, D. M., et al. Transforming growth factor-beta 1 produced by vascular smooth muscle cells predicts fibrosis in the gastrocnemius of patients with peripheral artery disease. J Transl Med. 14, 39 (2016).
- Skalli, O., et al. Alpha-smooth muscle actin, a differentiation marker of smooth muscle cells, is present in microfilamentous bundles of pericytes. J Histochem Cytochem. 37 (3), 315-321 (1989).
- von der Ecken, J., et al. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
