Een protocol om de morfologische veranderingen van<em> Clostridium difficile</em> In reactie op Antibiotische Behandeling

Summary

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Abstract

Beoordeling van antibiotische werking met nieuwe geneesmiddelontwikkeling gericht op anaërobe bacteriën is moeilijk en technisch veeleisend. Om inzicht te krijgen in mogelijke MOA, kunnen morfologische veranderingen in verband met de blootstelling aan antibiotica worden gedetecteerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Het integreren van SEM imaging met traditionele kill curves kan ons inzicht in drugsactie verbeteren en het drugontwikkelingsproces bevorderen. Om dit uitgangspunt te testen werden dodenkrommen en SEM-studies uitgevoerd met behulp van geneesmiddelen met bekende maar verschillende MOA (vancomycine en metronidazool). C. difficiele cellen (R20291) werden tot 48 uur met of zonder aanwezigheid van antibiotica gegroeid. Gedurende het 48 uur interval werden cellen verzameld op meerdere tijdspunten om de doeltreffendheid van antibiotica te bepalen en voor beeldvorming op de SEM. In overeenstemming met eerdere verslagen had vancomycine en metronidazole significante bactericide activiteit na 24 uur behandeling zoals gemeten door kolonievormende eenheid (CFU) landenting. Met behulp van SEM beeldvorming bleken we dat metronidazol significante effecten op cellengte had (> 50% reductie in cellengte voor elk antibioticum, P <0,05) in vergelijking met controles en vancomycine. Hoewel de fenotypische respons op medicijnbehandeling niet eerder op deze wijze is gedocumenteerd, zijn ze consistent met de MOA van het geneesmiddel, die de veelzijdigheid en betrouwbaarheid van de beeldvorming en metingen en de toepassing van deze techniek voor andere experimentele verbindingen aantoont.

Introduction

Clostridium difficile is een gram positieve , spore-vormende bacterie, die jaarlijks ongeveer 500.000 infecties veroorzaakt in de VS en wordt beschouwd als een dringend ziekteverwekkend patiënt door de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), het hoogste risico. ¹ Het afgelopen decennium heeft aanzienlijke drugontwikkeling in antimicrobiële stoffen met activiteit tegen C. difficile gezien . ^{2 , 3} In vitro studies zijn een noodzakelijk onderdeel van het geneesmiddelontwikkelingsproces. ⁴ Traditioneel worden in vitro gevoeligheids- en tijddodenstudies gebruikt om toekomstige dieren en andere in vivo studies te valideren.

Hoewel deze methoden een belangrijke rol spelen bij het evalueren van doden, nemen ze de fenotypische reactie van de cellen niet op de farmacologische behandeling vast. Door scanning elektronenmicroscopie (SEM) op te nemen met standarD doden van kinetische studies, is een meer grondige karakterisering van de antibiotische directe effecten mogelijk. ^{5 , 6 , 7} Hier presenteren wij een methode waarbij SEM gebruikt wordt als middel om de werkzaamheid van antibioticabehandeling te profileren.

Protocol

1. Isolatie van C. difficile uit verschillende milieu- of klinische bronnen Milieuisolaten: Gebruik een voorgesteriliseerd katoenmeter (licht bevochtigd met 0,85% NaCl), snijd het oppervlak van een bezienswaardigheid (vloer, deur, handvat, plank, enz. ). 8 Zorg ervoor dat u steriele handschoenen draagt ​​en de doek in een gesteriliseerde buis plaatst nadat u klaar bent. Klinische isolaten (ontlasting): Plaat 10 tot 100 mg klinische ontlastingmonsters op …

Representative Results

Clostridium difficile is een sporenvormende bacterie en daarom is het essentieel om de morfologische verschillen tussen vegetatieve en sporencellen voorafgaand aan elke functionele analyse te bepalen. Figuur 1 toont representatieve afbeeldingen van vegetatieve cellen die werden opgenomen tijdens de exponentiële fase van de groeicurve en de sporencellen. Zoals afgebeeld, zijn vegetatieve cellen lange, gladde, staafvormige structuren, terwijl sporen kleine, ovale…

Discussion

Het doel van de huidige studie was het creëren van een high-throughput methode voor het isoleren van C. difficile en het testen van antibiotica gevoeligheid met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) als middel om een ​​meer grondige karakterisering van de farmacologische werking van het antibiotica. Met behulp van de hierin beschreven protocollen hebben we aangetoond dat beeldvorming van de fenotypische reactie van de cel op antibiotische behandeling inzicht kan geven in de farmacologische werkin…

Materials

cotton gauze	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50mL tubes	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterion	C5141
L-cysteine	Alfa Aesar	A10389
yeast extract	Criterion	C741
sodium taurocholate	Alfa Aesar	A18346
anaerobic chamber	Coy		vinyl anaerobic chamber
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates	Anaerobe systems	AS-213
blood agar plates	Hardy diagnostics	A-10
latex agglutination reagent	Oxoid	DR1107A	C. diff test kit
microcentrifuge tubes	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	50-259-98
microscope slides	J. Melvin freed brand	7525M	75x25mm
flow hood	Labconco	Class II type A2	biosafety cabinet
desk sputtering machine	Denton Vacuum	Desk II
tape	Plastic Core	05072-AB	SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape
gold	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil
scanning electron microscope	FEI	XL-30