פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של<em> Clostridium difficile</em> בתגובה לטיפול אנטיביוטי
Summary
Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.
Abstract
הערכה של פעילות אנטיביוטית עם פיתוח תרופות חדשות מכוונת נגד חיידקים אנאירוביים קשה ותובענית מבחינה טכנית. כדי לקבל תובנה אפשרי MOA, שינויים מורפולוגיים הקשורים לחשיפה אנטיביוטיקה ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). שילוב הדמיה SEM עם עקומות להרוג מסורתיים עשוי לשפר את התובנה שלנו לתוך הפעולה סמים לקדם את תהליך הפיתוח של התרופה. כדי לבדוק את הנחת היסוד, להרוג עקומות ומחקרים SEM בוצעו באמצעות תרופות עם ידוע אך שונה MOA (vancomycin ו metronidazole). ג תאים difficile (R20291) גדלו עם או ללא נוכחות של אנטיביוטיקה עד 48 שעות. במהלך 48 שעות המרווח, תאים נאספו בנקודות זמן מרובות כדי לקבוע יעילות אנטיביוטיקה עבור הדמיה על SEM. בהתאם לדו"חות קודמים, vancomycin ו- metronidazole היו בעלי פעילות חיידקית משמעותית לאחר 24 שעות של טיפול, כפי שנמדד על ידי היחידה להרכיב מושבות (CFU)טינג. באמצעות הדמיה SEM קבענו כי metronidazole היו השפעות משמעותיות על אורך התא (> ירידה של 50% באורך התא עבור כל אנטיביוטיקה, P <0.05) לעומת בקרים ו ונקומיצין. בעוד התגובה הפנוטיפית לטיפול תרופתי לא תועדה בעבר באופן זה, הם עולים בקנה אחד עם MOA של התרופה המדגימה את הרבגוניות והאמינות של ההדמיה והמדידות ואת היישום של טכניקה זו עבור תרכובות ניסיוניות אחרות.
Introduction
Clostridium difficile הוא חיידק החיידק החיידקי , הגורם לגרימת כ -500,000 זיהומים בשנה בארה"ב ונחשב לאיום פתולוגי דחוף לאיום על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), רמת הסיכון הגבוהה ביותר. 1 בעשור האחרון חלה התפתחות משמעותית של תרופות במיקרוביאלים עם פעילות נגד C. difficile . 2 , 3 במבחנה הלימודים הם מרכיב הכרחי של תהליך הפיתוח של התרופה. 4 באופן מסורתי, רגישות במבחנה והזמן להרוג מחקרים משמשים כדי לאמת בעתיד חיה ואחרים במחקר vivo .
בעוד ששיטות אלה משמשות תפקיד חשוב בהערכת פעולת הריגה, הן אינן קולטות את התגובה הפנוטיפית של התאים לטיפול תרופתי. על ידי שילוב מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם standarD הריגת מחקרים קינטיים, אפיון יסודי יותר של ההשפעות הישירות של אנטיביוטיקה אפשרי. 5 , 6 , 7 כאן, אנו מציגים שיטה שבה SEM משמש כאמצעי פרופיל פרופיל היעילות של טיפול אנטיביוטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת המחקר הנוכחי הייתה ליצור שיטת תפוקה גבוהה לבידוד C. difficile ובדיקת רגישות אנטיביוטית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כאמצעי לאפיון יסודי יותר של הפעולה הפרמקולוגית של האנטיביוטיקה. באמצעות הפרוטוקולים המפורטים כאן, הוכחנו כי הדמיה התגובה הפנוטיפית של ה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.
Materials
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75x25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
Referências
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
