Un protocole pour caractériser les changements morphologiques de<em> Clostridium difficile</em> En réponse au traitement antibiotique

Summary

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Abstract

L'évaluation de l'action antibiotique avec un nouveau développement de médicament dirigé contre la bactérie anaérobie est difficile et techniquement exigeante. Pour obtenir un aperçu du MOA possible, les changements morphologiques associés à l'exposition aux antibiotiques peuvent être visualisés à l'aide d'une microscopie électronique à balayage (SEM). L'intégration de l'imagerie SEM avec des courbes de destruction traditionnelles peut améliorer notre vision de l'action antidrogue et favoriser le processus de développement de médicaments. Pour tester cette prémisse, les courbes de tuer et les études SEM ont été menées en utilisant des médicaments connus mais différents MOA (vancomycine et métronidazole). Les cellules de C. difficile (R20291) ont été cultivées avec ou sans antibiotiques pendant jusqu'à 48 h. Tout au long de l'intervalle de 48 h, les cellules ont été recueillies à plusieurs moments pour déterminer l'efficacité des antibiotiques et pour l'imagerie sur la SEM. Conformément aux rapports précédents, la vancomycine et le métronidazole ont eu une activité bactéricide significative après 24 heures de traitement, tel que mesuré par un pays de l'unité de colonisation (CFU)Ting. En utilisant l'imagerie SEM, nous avons déterminé que le métronidazole avait des effets significatifs sur la longueur de la cellule (> réduction de 50% de la longueur de la cellule pour chaque antibiotique, P <0,05) par rapport aux témoins et à la vancomycine. Alors que la réponse phénotypique au traitement médicamenteux n'a pas été documentée précédemment de cette manière, elles sont compatibles avec le MOA du médicament démontrant la polyvalence et la fiabilité de l'imagerie et des mesures et l'application de cette technique pour d'autres composés expérimentaux.

Introduction

Clostridium difficile est une bactérie bactérienne positive aux grammes, qui provoque environ 500 000 infections chaque année aux États-Unis et est considéré comme un agent pathogène urgent pour les niveaux de menace par les Centers for Disease Control and Prevention (CDC), le plus haut niveau de risque. ¹ La dernière décennie a connu un développement considérable de médicaments chez les antimicrobiens ayant une activité contre C. difficile . ^{2 , 3} Les études in vitro sont une composante nécessaire du processus de développement de médicaments. ⁴ Traditionnellement, les études de susceptibilité et de mortalité in vitro sont utilisées pour valider les futures études animales et autres études in vivo .

Bien que ces méthodes jouent un rôle important pour évaluer les actions de destruction, elles ne captent pas la réponse phénotypique des cellules au traitement pharmacologique. En incorporant la microscopie électronique à balayage (SEM) avec standarEn cas d'études cinétiques, une caractérisation plus complète des effets directs des antibiotiques est possible. ^{5 , 6 , 7} Ici, nous présentons une méthode où la SEM est utilisée comme moyen de profiler l'efficacité du traitement antibiotique.

Protocol

1. Isoler C. difficile à partir de différentes sources environnementales ou cliniques Isolats environnementaux: À l'aide d'une jauge de coton pré-stérilisée (légèrement mouillée avec NaCl à 0,85%), tamponnez la surface de toute zone d'intérêt (plancher, porte, poignée, étagère, etc. ). 8 Assurez-vous de porter des gants stériles et placez l'écouvillon dans un tube stérilisé après avoir terminé. Isolats cliniques (selles):…

Representative Results

Clostridium difficile est une bactérie formant des spores et il est donc essentiel de déterminer les différences de morphologie entre les cellules végétatives et les spores avant toute analyse fonctionnelle. La figure 1 illustre les images représentatives des cellules végétatives qui ont été capturées pendant la phase exponentielle de la courbe de croissance et des cellules de spores. Comme représenté, les cellules végétatives sont longues, lisses…

Discussion

L'objectif de l'étude actuelle était de créer une méthode à haut débit pour isoler C. difficile et tester la sensibilité aux antibiotiques à l'aide d'une microscopie électronique à balayage (SEM) comme moyen pour une caractérisation plus approfondie de l'action pharmacologique de l'antibiotique. En utilisant les protocoles décrits ici, nous avons démontré que l'imagerie de la réponse phénotypique de la cellule au traitement antibiotique peut révéler un aperçu de l&…

Materials

cotton gauze	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50mL tubes	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterion	C5141
L-cysteine	Alfa Aesar	A10389
yeast extract	Criterion	C741
sodium taurocholate	Alfa Aesar	A18346
anaerobic chamber	Coy		vinyl anaerobic chamber
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates	Anaerobe systems	AS-213
blood agar plates	Hardy diagnostics	A-10
latex agglutination reagent	Oxoid	DR1107A	C. diff test kit
microcentrifuge tubes	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	50-259-98
microscope slides	J. Melvin freed brand	7525M	75x25mm
flow hood	Labconco	Class II type A2	biosafety cabinet
desk sputtering machine	Denton Vacuum	Desk II
tape	Plastic Core	05072-AB	SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape
gold	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil
scanning electron microscope	FEI	XL-30