형태 변화를 규명하기위한 프로토콜<em> 클로스 트리 디움 디피 실</em> 항생제 치료에 대한 반응
Summary
Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.
Abstract
혐기성 박테리아에 대한 신약 개발로 항생제 작용을 평가하는 것은 어렵고 기술적으로 까다 롭습니다. 가능한 MOA에 대한 통찰력을 얻으려면 항생제 노출과 관련된 형태 학적 변화를 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 전통적인 살인 곡선과 SEM 이미징을 통합하면 약물 작용에 대한 우리의 통찰력을 향상시키고 약물 개발 프로세스를 향상시킬 수 있습니다. 이 전제를 테스트하기 위해 알려진 MOA (vancomycin 및 metronidazole)를 가진 약물을 사용하여 곡선을 죽이고 SEM 연구를 수행했습니다. C. difficile 세포 (R20291)는 항생제의 존재 또는 부재하에 48 시간까지 성장시켰다. 48 시간 간격으로 항생제 유효성을 결정하고 SEM에서 영상을 얻기 위해 여러 시점에서 세포를 수집했습니다. 이전 보고서와 일치하여, vancomycin과 metronidazole은 식민지 형성 단위 (colony-forming unit, CFU)에서 측정 한 24 시간 처리 후에도 상당한 살균 활성을 보였다.팅. SEM 이미징을 사용하여 metronidazole은 대조군과 vancomycin에 비해 세포 길이에 유의 한 영향을 주었다 (각 항생제의 세포 길이가 50 % 이상 감소, P <0.05). 약물 치료에 대한 표현형 반응은 이전에 이러한 방식으로 문서화되지 않았지만, 약물의 MOA와 일관성이 있으며, 이미징 및 측정의 다양성과 신뢰성 및 다른 실험 화합물에 대한이 기술의 적용을 입증합니다.
Introduction
Clostridium difficile 은 그람 양성, 포자 형성 세균으로 매년 미국에서 약 50 만 건의 감염을 일으키며 질병 위험 예방 센터 (CDC)에서 위협 수준의 긴급 병원체로 간주됩니다. 1 지난 10 년 동안 C. difficile 에 대한 항균제 개발에 상당한 약물 개발이 있었습니다 . 2 , 3 시험 관내 연구는 약물 개발 과정의 필수 구성 요소입니다. 전통적으로 in vitro 감수성 및 시간 사멸 연구는 미래의 동물 및 기타 생체 내 연구를 검증하는 데 사용됩니다.
이 방법은 살상 행동을 평가하는 데 중요한 역할을하지만, 약리학 적 치료에 대한 세포의 표현형 반응을 포착하지는 않습니다. 표준 전자 현미경 (SEM)을 통합하여동역학 연구를 중단하면 항생제 직접 효과에 대한보다 철저한 특성 분석이 가능하다. 5 , 6 , 7 여기서 우리는 SEM을 항생제 치료의 효능을 설명하는 수단으로 사용하는 방법을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 연구의 목표는 C. difficile을 분리 하고 항생제의 약리 작용을보다 철저히 특성화하기위한 수단으로 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 항생제 감수성을 검사하는 높은 처리량 방법을 만드는 것이 었습니다. 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 우리는 항생제 치료에 대한 세포의 표현형 반응을 이미지화하면 약물의 약리 작용에 대한 통찰력을 확인할 수 있음을 입증했습니다. 전체적?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.
Materials
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75x25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
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