التصوير الخلية الحية من خلايا الدم المسمى في الدورة الدموية العين يمكن أن توفر معلومات عن التهاب ونقص التروية في اعتلال الشبكية السكري والانحطاط البقعي المرتبط بالعمر. ويرد وصف بروتوكول لتسمية خلايا الدم وصورة الخلايا المسمى في الدورة الدموية في شبكية العين.
قد توفر ديناميات تدفق الدم الشبكية والمشيمية نظرة ثاقبة على الفيزيولوجيا المرضية وعقابيل أمراض العين المختلفة، مثل الزرق، اعتلال الشبكية السكري، الضمور البقعي المرتبط بالعمر (أمد) وغيرها من الظروف الالتهابية العين. وقد يساعد أيضا على رصد الاستجابات العلاجية في العين. وضع العلامات المناسبة لخلايا الدم، إلى جانب التصوير خلية حية من الخلايا المسمى، ويسمح للتحقيق في ديناميات تدفق في شبكية العين و الدورة الدموية المشيمية. هنا، نحن تصف بروتوكولات موحدة من 1.5٪ الإندوسيانين الأخضر (إيسغ) و 1٪ الصوديوم فلوريسئين وصفها من الكريات الحمراء الفئران والكريات البيض، على التوالي. تم تطبيق المسح الضوئي منظار العين الليزر (سلو) لتصور الخلايا المسمى في الدورة الدموية في شبكية العين من الفئران C57BL / 6J (نوع البرية). أظهر كلا الأسلوبين الخلايا فلورزنتلي المسمى متميزة في الدورة الدموية في شبكية العين الماوس. هذه الطرق وضع العلامات يمكن أن يكون تطبيقات أوسع في مختلف أمراض العينعارضات ازياء.
دراسة ديناميات تدفق خلايا الدم في الدورة الدموية في شبكية العين والمشيمية أمر حتمي لفهم التسبب في الأمراض التي يحتمل أن تكون مهددة الرؤية الرؤية وغيرها من الظروف الالتهابية العين. ومع ذلك، فإن تقنيات تصوير الأوعية التقليدية، والتي تنطوي على ملزمة الأصباغ الفلورية للبروتينات البلازما، لا توفر أي معلومات بشأن ديناميات كرات الدم الحمراء أو الكريات البيض 1 . ديناميات تدفق الشبكية كرات الدم الحمراء مهمة لدراسة الدورة الدموية كفاءة الأيض في شبكية العين، وديناميات تدفق الكريات البيض، لفهم الهجرة الخلية، والاعتراف، والتصاق والدمار في مختلف الظروف الالتهابية 2 . هناك العديد من جزيئات الفلورسنت المستخدمة في تحديد وتوصيف أنواع الخلايا المختلفة 3 . يمكن قياس ديناميكا الدم من خلايا الدم عن طريق تلطيخها مع فلوريس المناسبةسنت الأصباغ وتطبيق تقنيات التصوير المناسبة 4 .
وجود الاستجابات الالتهابية في أمراض العين مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (أمد) واعتلال الشبكية السكري (در) تنطوي على تراكم الخلايا الليمفاوية في المنطقة المريضة 5 ، 6 . تتبع الخلايا المناعية في الأنسجة يمكن أن تساعد على فهم الأحداث المعقدة المشاركة في آلية المرضية المرضية. استخدمت النظائر المشعة مثل 51 كر و 125 أنا كما تتبع الخلايا في الدراسات المبكرة. هذه الأصباغ هي سامة وتؤثر على بقاء الخلية. على الرغم من أن العلامات المشعة 3 H و 14 C هي أقل سمية للخلايا، نظرا لطاقات انبعاثها أقل، فمن الصعب للكشف عن إشاراتها في النظام 7 ، 8 . تم إدخال عدد من الأصباغ اللامعة للتغلب على المشاكل المحتملة المرتبطة ثإيث علامات المشعة وتتبع هجرة الخلايا الليمفاوية في المختبر باستخدام المجهر الفلورسنت وتدفق الخلوي 9 ، 10 . هوشست 33342 وثيازول البرتقال هي الحمض النووي ملزمة الأصباغ الفلورية، والتي تستخدم لتعقب الخلايا الليمفاوية في الجسم الحي. هويشت 33342 يربط إلى المناطق الغنية في أت في الحمض النووي، هو غشاء نفاذية، يحتفظ إشارات الفلورسنت لمدة 2-4 أيام ومقاومة لتبريد 9 ، 10 . عيوب هويشت 33342 وثيازول البرتقال هي تثبيط انتشار الخلايا الليمفاوية 11 ونصف عمر قصير، على التوالي 9 .
كالسين-آم، فلوريسئين دياسيتات (فدا)، 2 '، 7'- مكرر (2-كاربوكسيثيل) -5- (و -6) -carboxy فلورسين، استر أسيتوكسيميثيل (بسكف-آم)، 5- (و -6) كاربوكسيفلورسين دياسيتات (كفدا)، و 5- (و -6) -carboxyfluorcein ديسيتات أسيتوكسيميثيل استر (كفدا-آم)هي الأصباغ الفلورية السيتوبلازمية المستخدمة للدراسات الهجرة اللمفاوية. ومع ذلك، فدا، كفدا و كفدا-آم ديك الاحتفاظ أقل في الخلايا 9 . بسيف-آم يقلل من الاستجابة التكاثري ويؤثر على الكيميائي وإنتاج الفائق 6 ، 12 . كالسين-آم هو صبغة الفلورسنت ومفيدة على المدى القصير في دراسات الهجرة اللمفاويات الجسم الحي . تنبعث منها إشارات فلورية قوية، لا تتداخل مع معظم الوظائف الخلوية وتحتفظ بإشارات الفلورسنت لمدة تصل إلى 3 أيام 12 ، 13 . فلوريسئين إيسوثيوسيانات (فيتس) و كاربوكسيفلورسين دياسيتات سوتسينيميديل استر (كفدا-سي) هي التساهمية اقتران الأصباغ الفلورية، والتي تستخدم للدراسات الهجرة اللمفاوية. فيتس المعارض أي تأثير على بقاء الخلية ولها تقارب أقوى مع الخلايا الليمفاوية B من الخلايا الليمفاوية T 14 ، 15 </suص>. ويمكن تعقب الخلايا الليمفاوية المسمى كفدا-سي في الجسم الحي لأكثر من 8 أسابيع وتصل إلى 8 الانقسامات الخلية 9 ، 16 . C1 دي (1،1'-ديوكتاديسيل-3،3،3 '، 3'-تيتراميثيليندوكاربوسيانين بيركلورات)، ديو (3،3'- ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانين بيركلورات)، بول كارل هوران (يخ) 2، PKH3، و PKH26 هي غشاء- إدراج الأصباغ الكاربوسيانين الفلورسنت محبة للدهون المستخدمة لتسمية الكريات البيض والكريات الحمراء. C18 ديل و ديو المعرض إشارات أعلى عند دمجها في غشاء الخلية وغير نسبيا غير سامة 12 ، 17 . PKH2، PKH3 و PKH26 الخلايا المسمى تحمل الاحتفاظ الجيد للإشارات الفلورسنت مع أقل سمية 18 ، 19 ، 20 ، 21 ، 22 . ومع ذلك، PKH2 أسفل ينظم التعبير CD62L ويقلل من لي بقاء خلية مبوية 23 .
وقد أجريت معظم الدراسات المذكورة أعلاه لتتبع هجرة الخلايا الليمفاوية وانتشار في اللمفاويات ودراسة الكريات الحمراء المسمى في الدورة الدموية غير العين. هناك عدد قليل جدا من الدراسات تطبيق تقنيات وضع العلامات لدراسة خلايا الدم في الدورة الدموية العين. تطبيق المسح الضوئي منظار العين ليزر (سلو) لديه ميزة كبيرة في دراسة الخلايا المسمى في شبكية العين والدورة الدموية المشيمية في الجسم الحي بواسطة قاع الأوعية تصوير 24 . هناك عدة أصباغ الفلورسنت، مثل إيسغ، أكريدين البرتقال، فيتس، فلوريسئين الصوديوم، و كفدا التي تستخدم لدراسة الكريات البيض في الدورة الدموية في شبكية العين من قبل سلو 25 ، 26 ، 27 ، 28 ، 29 ، 30 ،كلاس = "كريف"> 31 ، 32 ، 33 ، 34 . السمية الضوئية والسرطانية من أكريدين البرتقال 26 ، 27 ، تدخل فيتس مع النشاط الخلوي، ومتطلبات عامل تباين داخل الأوعية لحل الأوعية الدموية في شبكية العين والأوعية الدموية المشيمية يحد من تطبيقها في التجارب الحيوانية في الجسم الحي 29 . فلوريسئين الصوديوم و إيسغ هي غير سامة، التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء، وآمنة لاختبار على البشر 32 ، 35 . ترتبط معظم الدراسات الديناميكية تدفق إلى وضع العلامات من الكريات البيض أو كرات الدم الحمراء والتصور لها في شبكية العين والأوعية الدموية المشيمية 36 ، 37 ، 38 ، 39 </sتصل>. هنا، نحن تصف بروتوكول موحد من إيسغ وضع العلامات من كرات الدم الحمراء، ووصف فلوريسئين الصوديوم من الكريات البيض، وتتبع الخلايا المسمى تصور في دوران الشبكية الماوس باستخدام سلو.
دراسة ديناميكا الدم في دوران الشبكية والمشيمية أمر حيوي لفهم الفيزيولوجيا المرضية للعديد من أمراض العين. ويمكن دراسة ديناميات تدفق الدم في الدورة الدموية في شبكية العين من قبل التصوير الفوتوغرافي التماسك البصري فورييه المجال (فد-أوكت)، فلوغرافي الليزر الرقطة (لسفغ)…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل المشروع البحثي بموجب منحة المحقق الجديد من المجلس الوطني للبحوث الطبية (نمرك)، سنغافورة. ويود الفريق أن يعترف بالتدريب البحثي المقدم إلى الدكتور أغروال في معهد طب العيون (إيو)، كلية لندن الجامعية (أوكل) في إطار المجلس الوطني للبحوث الطبية (نمرك) زمالة التدريب في الخارج من نوفمبر 2012 حتى أكتوبر 2014 تحت إشراف البروفيسور. ديفيد شيما. اكتسب الدكتور أغروال مفهوم ومهارات لوضع العلامات على الخلايا والتصوير الحي في مختبر الدكتور شيما. وبالتالي فإن الفريق يود أن يعترف الإشراف والتوجيه خلال الزمالة التدريب من البروفسور ديفيد شيما، Pro.f كينيث ميسنر، الدكتور بيتر لونده والدكتور دايجو إيواتا.
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
Microcentrifuge tubes 2mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
Shaker incubator | Lab Tech | ||
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
Vidisic Gel 10G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |