Etiquetado de colorantes fluorescentes de eritrocitos y leucocitos para estudiar la dinámica de flujo en la circulación de la retina del ratón
Summary
Las imágenes de células vivas de las células sanguíneas etiquetadas en la circulación ocular pueden proporcionar información sobre la inflamación y la isquemia en la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad. Se describe un protocolo para etiquetar células sanguíneas e imágenes de las células marcadas en la circulación retiniana.
Abstract
La dinámica del flujo sanguíneo retinal y coroideo puede proporcionar una visión de la fisiopatología y secuelas de diversas enfermedades oculares, como el glaucoma, la retinopatía diabética, la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y otras afecciones inflamatorias oculares. También puede ayudar a controlar las respuestas terapéuticas en el ojo. El etiquetado adecuado de las células sanguíneas, junto con la obtención de imágenes de células vivas de las células marcadas, permite investigar la dinámica del flujo en la circulación retinal y coroidea. Aquí, se describen los protocolos estandarizados de 1,5% indocyanine green (ICG) y 1% fluoresceína de sodio etiquetado de ratones eritrocitos y leucocitos, respectivamente. Se aplicó una oftalmoscopia láser de exploración (SLO) para visualizar las células marcadas en la circulación retiniana de ratones C57BL / 6J (tipo salvaje). Ambos métodos demostraron distintas células marcadas con fluorescencia en la circulación retiniana del ratón. Estos métodos de etiquetado pueden tener aplicaciones más amplias en diversas enfermedades ocularesModelos.
Introduction
El estudio de la dinámica de flujo de las células sanguíneas en la retina y la circulación coroidea es imprescindible para comprender la patogénesis de las enfermedades oculares potencialmente amenazadoras de la visión y otras afecciones inflamatorias oculares. Sin embargo, las técnicas de angiografía convencionales, que implican la unión de colorantes fluorescentes a proteínas plasmáticas, no proporcionan ninguna información con respecto a la dinámica de los eritrocitos o leucocitos 1 . La dinámica del flujo retiniano eritrocitario es importante para el estudio de la circulación metabólicamente eficiente en la retina y la dinámica del flujo leucocitario, para comprender la migración celular, el reconocimiento, la adhesión y la destrucción en diversas condiciones inflamatorias. Existen varias moléculas fluorescentes utilizadas en la identificación y caracterización de diversos tipos de células 3 . La hemodinámica de las células sanguíneas puede medirse teñiéndolas con las fluorescentes apropiadasY aplicar las técnicas de imagen adecuadas 4 .
La presencia de respuestas inflamatorias en las enfermedades intraoculares como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la retinopatía diabética (DR) implican la acumulación de linfocitos en el área enferma 5 , 6 . El seguimiento de las células inmunes en los tejidos puede ayudar a entender los complejos eventos involucrados en el mecanismo de la patogénesis de la enfermedad. Isótopos radiactivos como 51 Cr y 125 I se utilizaron como trazadores celulares en los primeros estudios. Estos colorantes son tóxicos y afectan la viabilidad celular. Aunque los marcadores radioactivos 3H y 14C son menos tóxicos para las células, debido a sus energías de emisión más bajas, es difícil detectar sus señales en el sistema 7 , 8 . Se introdujeron una serie de colorantes fluorocromos para superar los problemas potenciales asociados wCon marcadores radioactivos y seguimiento de la migración de linfocitos in vitro utilizando microscopía fluorescente y citometría de flujo [ 9 , 10] . Hoechst 33342 y naranja de tiazol son colorantes fluorescentes de unión al ADN, que se usan para rastrear linfocitos in vivo. Hoechst 33342 se une a regiones ricas en AT en el ADN, es permeable a la membrana, retiene las señales fluorescentes durante 2 – 4 días y es resistente al enfriamiento 9 , 10 . Las desventajas de Hoechst 33342 y tiazol naranja son la inhibición de la proliferación de linfocitos 11 y la semivida corta, respectivamente 9 .
Calcein-AM, diacetato de fluoresceína (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (y 6) -carboxifluoresceína, éster acetoximetilico (BCECF-AM), 5- (y 6) Diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) y éster acetoximetilico de diacetato de 5- (y 6) – carboxifluoresceína (CFDA – AM)Son los colorantes fluorescentes citoplasmáticos utilizados para estudios de migración de linfocitos. Sin embargo, FDA, CFDA y CFDA-AM tienen menor retención en las células [ 9] . BCECF-AM reduce la respuesta proliferativa e influye en la quimiotaxis y la producción de superóxido 9 , 12 . Calcein-AM es un colorante fluorescente y útil para estudios de migración de linfocitos in vivo a corto plazo. Emite señales fluorescentes fuertes, no interfiere con la mayoría de las funciones celulares y retiene las señales fluorescentes hasta por 3 días 12 , 13 . El isotiocianato de fluoresceína (FITC) y el éster de succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína (CFDA-SE) son colorantes fluorescentes de acoplamiento covalentes, que se usan para estudios de migración de linfocitos. FITC no muestra ningún efecto sobre la viabilidad celular y tiene una mayor afinidad con los linfocitos B que los linfocitos T 14 , 15 </suP Los linfocitos marcados con CFDA-SE pueden rastrearse in vivo durante más de 8 semanas y hasta 8 divisiones celulares 9 , 16 . Dihidrato de C _ {18} Di (dihidrato de 1,1 '- dioctadecil – 3,3,3', 3 '- tetrametilindocarbocianina), DiO (perclorato de 3,3' – dioctadeciloxacarbocianina), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 y PKH26, Insertando tintes fluorescentes de carbocianina lipófilos usados para marcar leucocitos y eritrocitos. C18 Dil y DiO exhiben señales más altas cuando se incorporan en la membrana celular y son relativamente no tóxicos 12 , 17 . Las células marcadas con PKH2, PKH3 y PKH26 exhiben una buena retención de las señales fluorescentes con menos toxicidad 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Sin embargo, PKH2 regula la expresión de CD62L y reduce Viabilidad de los fmocitos 23 .
La mayoría de los estudios mencionados anteriormente se han realizado para rastrear la migración y proliferación de linfocitos en los linfáticos y estudiar los eritrocitos marcados en la circulación no ocular. Hay muy pocos estudios que apliquen las técnicas de etiquetado para estudiar las células sanguíneas en la circulación ocular. Aplicación de la oftalmoscopia láser de escaneo (SLO) tiene una gran ventaja en el estudio de las células etiquetadas en la retina y la circulación coroidea in vivo por fundus angiografía [ 24] . Existen varios colorantes fluorescentes, tales como ICG, naranja de acridina, FITC, fluoresceína sódica y CFDA que se usan para estudiar los leucocitos en la circulación retiniana por SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Clase 31,32,33,34. La fototoxicidad y la carcinogenicidad de la naranja de acridina 26,27, la interferencia de FITC con la actividad celular y la necesidad de un agente de contraste intravascular para la resolución de los vasos sanguíneos retinianos y coroideos limita su aplicación en experimentos con animales in vivo 29 . La fluoresceína sódica y el ICG son no tóxicos, aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos, y son seguros para las pruebas en seres humanos 32 , 35 . La mayoría de los estudios dinámicos de flujo están relacionados con el etiquetado de los leucocitos o eritrocitos y su visualización en los vasos sanguíneos retinales y coroides 36 , 37 , 38 , 39 </sArriba En este sentido, se describe un protocolo normalizado de ICG etiquetado de los eritrocitos, fluoresceína de sodio etiquetado de los leucocitos, y el seguimiento de las células visualizadas etiquetadas en el ratón retinal circulación utilizando SLO.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estudio de la hemodinámica en la retina y la circulación coroidea es vital para la comprensión de la fisiopatología de muchas enfermedades oculares. La dinámica del flujo sanguíneo en la circulación de la retina puede ser estudiada por tomografía de coherencia óptica de dominio de Fourier (FD-OCT), láser speckle flowgraphy (LSFG) y oximetría de retina. Aunque estos métodos utilizan diferentes enfoques para estudiar el flujo sanguíneo total en la circulación retiniana, comparten la limitación de la inca…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El proyecto de investigación fue financiado bajo la beca New Investigator del National Medical Research Council (NMRC), Singapur. El equipo querrá agradecer el entrenamiento de investigación proporcionado al Dr. Agrawal en el Instituto de Oftalmología (IoO), University College London (UCL) bajo el Consejo Nacional de Investigación Médica (NMRC) Overseas Research Training Fellowship de noviembre de 2012 hasta octubre de 2014 bajo la tutoría del Prof. David Shima. El Dr. Agrawal adquirió el concepto y las habilidades para etiquetar las células y las imágenes en vivo en el laboratorio del Dr. Shima. Por lo tanto, el equipo agradecerá la supervisión y orientación durante la beca de formación del Prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, el Dr. Peter Lundh y el Dr. Daiju Iwata.
Materials
| Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Microcentrifuge tubes 2mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Shaker incubator | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |
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