Fare Retinal Sirkülasyonunda Akış Dinamikleri Çalışmak İçin Eritrositler ve Lökositlerin Floresan Boya Etiketlenmesi
Summary
Göz dolaşımındaki etiketli kan hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi, diyabetik retinopati ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyonda inflamasyon ve iskemi hakkında bilgi sağlayabilir. Kan hücrelerini etiketlemek ve retinal dolaşımda etiketli hücreleri imal etmek için bir protokol tarif edilmiştir.
Abstract
Retinal ve koroidal kan akımı dinamikleri, glokom, diyabetik retinopati, yaşla ilişkili maküla dejenerasyonu (AMD) ve diğer oküler inflamatuvar durumlar gibi çeşitli göz hastalıklarının patofizyolojisi ve sekeli hakkında fikir sağlayabilir. Ayrıca, gözdeki terapötik tepkilerin izlenmesine yardımcı olabilir. Etiketlenmiş hücrelerin canlı hücre görüntülemesi ile birleştirilmiş kan hücrelerinin doğru şekilde etiketlenmesi, retina ve koroid sirkülasyonundaki akış dinamiğinin incelenmesine olanak tanır. Burada, sırasıyla, farelerde eritrositler ve lökositler için% 1.5 indosiyanin yeşili (ICG) ve% 1 sodyum fluorescein'in standart protokollerini açıklıyoruz. Taramalı lazer oftalmoskopi (SLO), C57BL / 6J farelerinin (vahşi tip) retina dolaşımındaki etiketli hücreleri görselleştirmek için uygulandı. Her iki yöntem fare retinal dolaşımında farklı floresanla etiketlenmiş hücreler gösterdi. Bu etiketleme yöntemleri çeşitli oküler hastalıklarda daha geniş uygulamalara sahip olabilirmodelleri.
Introduction
Retina ve koroid sirkülasyonunda kan hücrelerinin akış dinamiklerini incelemek, görme engelli göz hastalıkları ve diğer oküler inflamatuvar durumların patogenezini anlamak için şarttır. Bununla birlikte, floresan boyaların plazma proteinlerine bağlanmasını içeren geleneksel anjiyografi teknikleri, eritrositlerin veya lökositlerin dinamikleri ile ilgili herhangi bir bilgi sağlamaz 1 . Eritrosit retina akışı dinamikleri, çeşitli inflamatuar koşullarda hücre göçü, tanıma, adezyon ve yıkımı anlamak için retinadaki metabolik olarak etkili dolaşımı ve lökosit akış dinamiğini incelemek için önemlidir 2 . Çeşitli hücre tiplerinin tanımlanmasında ve tanımlanmasında kullanılan çeşitli floresan molekülleri vardır 3 . Kan hücrelerinin hemodinamiği, uygun floresanla boyanarak ölçülebilirSent boyalar ve uygun görüntüleme tekniklerinin uygulanması 4 .
Yaşa bağlı maküler dejenerasyon (AMD) ve diyabetik retinopati (DR) gibi göz içi hastalıklarında inflamatuar yanıtların varlığı, hastalıklı bölgedeki lenfosit birikimini içerir 5,6 . Dokulardaki bağışıklık hücrelerinin takibi, hastalık patogenezi mekanizması içerisinde yer alan karmaşık olayları anlamaya yardımcı olabilir. Erken çalışmalarda hücre izleyicileri olarak 51 Cr ve 125 I gibi radyoaktif izotoplar kullanılmıştır. Bu boyalar toksiktir ve hücre yaşayabilirliğini etkiler. Radyoaktif işaretleyiciler 3 H ve 14 C, düşük emisyon enerjileri nedeniyle hücrelere karşı daha az toksik olmasına rağmen, sistemdeki sinyallerini algılamak zordur 7,8. Bir dizi florokrom boyası, w ile ilgili potansiyel problemlerin üstesinden gelmek için getirildi.İth radyoaktif işaretleyiciler ve flöresif mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak in vitro lenfosit göçünü izlemek 9,10. Hoechst 33342 ve thiazole orange, in vivo olarak lenfositleri izlemek için kullanılan DNA bağlayıcı flüoresan boyalardır . Hoechst 33342, DNA'daki AT zengini bölgelere bağlanır, membrana geçirgentir, flüoresan sinyallerini 2-4 gün korur ve söndürmeye dirençlidir 9 , 10 . Hoechst 33342 ve tiazol portakalın dezavantajları, sırasıyla lenfosit proliferasyonunun inhibisyonu 11 ve kısa yarılanma ömrüdür.
Calcein-AM, floresein diasetat (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-karboksietil) -5- (ve-6) -karboksifloresen, asetoksimetil ester (BCECF-AM), 5- (ve-6) – Karboksiflüoresein diasetat (CFDA) ve 5- (ve-6) -karboksiflüoresein diasetat asetoksimetil ester (CFDA-AM)Lenfosit migrasyon çalışmaları için kullanılan sitoplazmik floresan boyalardır. Bununla birlikte, FDA, CFDA ve CFDA-AM, hücrelerde daha düşük saklama süresine sahiptir 9 . BCECF-AM proliferatif yanıtı azaltır ve kemotaksi ve süperoksit üretimini etkiler 9,12. Calcein-AM flüoresan bir boyadır ve kısa süreli in vivo lenfosit göç çalışmaları için yararlıdır. Güçlü floresan sinyalleri yayar, hücresel işlevlerin çoğuna müdahale etmez ve floresan sinyallerini 3 güne kadar korur 12,13. Floresan izotiyosiyanat (FITC) ve karboksiflüoresein diasetat sukkinimidil ester (CFDA-SE), lenfosit migrasyon çalışmaları için kullanılan kovalent bağlama floresan boyalarıdır. FITC, hücre canlılığı üzerinde herhangi bir etki göstermez ve B lenfositleri ile T lenfositlerine kıyasla daha güçlü bir afiniteye sahiptir. 14 , 15 </sup>. CFDA-SE etiketli lenfositler 8 haftalık ve 8 hücre bölünmesi 9 , 16'ya kadar in vivo izlenebilir. C18 DiI (1,1'-dioktadesil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat), DiO (3,3'-dioktadesiloksakarbosiyanin perklorat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 ve PKH26, Lökositler ve eritrositlerin etiketlenmesinde kullanılan floresan lipofilik karbosiyanin boyalarının yerleştirilmesi. C18 Dil ve DiO, hücre zarına dahil edildiğinde daha yüksek sinyaller verirler ve nispeten toksik olmayan 12,17 dir. PKH2, PKH3 ve PKH26 etiketli hücreler, flüoresan sinyallerinin iyi tutulmasını, daha az toksisite 18 , 19 , 20 , 21 , 22 ile sergilemektedir. Bununla birlikte, PKH2, CD62L ekspresyonunu düzenler ve Mfosit canlılığı 23 .
Yukarıda bahsedilen çalışmaların çoğu, lenfatiklerde lenfosit göçü ve proliferasyonunun izlenmesi ve oküler olmayan dolaşımdaki etiketli eritrositlerin incelenmesi için yapılmıştır. Oküler dolaşımdaki kan hücrelerini incelemek için etiketleme tekniklerini uygulayan çok az çalışma bulunmaktadır. Taramalı lazer oftalmoskopinin (SLO) uygulanması, fundus anjiyografi vasıtasıyla in vivo retinal ve koroid sirkülasyonundaki etiketli hücrelerin incelenmesinde büyük bir avantaja sahiptir. Retinal dolaşımdaki lökositleri incelemek için kullanılan ICG, akridin portakalı, FITC, sodyum floresein ve CFDA gibi birkaç floresan boyası, 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . Akridin portakal 26 , 27'nin fototoksisite ve karsinojenisitesi, FITC'nin hücresel aktiviteye müdahalesi ve retinal ve koroidal kan damarlarının çözünürlüğü için intravasküler kontrast madde gereksinimi, in vivo hayvan deneylerinde uygulamalarını sınırlar 29 . Sodyum fluorosein ve ICG toksik değildir, Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanmıştır ve insanlardaki testler 32 , 35 için güvenlidir. Akışın dinamik çalışmalarının çoğu, lökositlerin veya eritrositlerin etiketlenmesi ve retinal ve koroidal kan damarlarında görselleştirilmesi ile ilgilidir 36,37,38,39 </s> Yukarı. Burada, eritrositlerin ICG etiketlemesinin standartlaştırılmış bir protokolünü, lökositlerin sodyum fluorescein etiketlemesini ve SLO kullanılarak fare retinal dolaşımında görselleştirilmiş etiketli hücrelerin izlenmesini anlatacağız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birçok oküler hastalığın patofizyolojisini anlamak için retinal ve koroid sirkülasyonundaki hemodinamiğin araştırılması hayati önem taşımaktadır. Retinal dolaşımdaki kan akımı dinamikleri Fourier domain optik koherens tomografi (FD-OCT), lazer speckle flowgraphy (LSFG) ve retinal oksimetre ile incelenebilir. Bu yöntemler, retinal dolaşımdaki toplam kan akışını incelemek için farklı yaklaşımlar kullansalar da, 40 , 41 , <…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırma projesi Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (NMRC), Singapur'dan Yeni Araştırmacı tarafından finanse edildi. Ekip, Kasım 2012'den Ekim 2014'e kadar Prof. Dr. Rahibe Gül'ün danışmanlığı altında Ulusal Tıbbi Araştırmalar Konseyi (NMRC) Yurtdışı Araştırma Eğitim Bursu kapsamında Gözlemevi Enstitüsü (Io), Londra Üniversitesi Koleji (UCL) üzerinde Dr Agrawal'a verilen araştırma eğitimini onaylamak istiyor. David Shima. Agrawal, Dr. Shima'nın laboratuvarında hücrelerin etiketlenmesi ve canlı görüntüleme konsepti ve becerileri edinmiştir. Ekip, dolayısıyla Prof. David Shima, Kenit Meissner, Dr. Peter Lundh ve Dr. Daiju Iwata'nın eğitim arkadaşlığı sırasında gözetim ve rehberliği kabul etmek istiyor.
Materials
| Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Microcentrifuge tubes 2mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Shaker incubator | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |
Referências
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23 (5), 975-987 (2013).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
- Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58 (3), 353-363 (2006).
- Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366 (13), 1227-1239 (2012).
- Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
- Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, (1978).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
- Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
- Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
- DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
- Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
- Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
- Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
- Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
- Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
- Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
- Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
- Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
- Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
- Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
- Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47 (6), 572-577 (2003).
- Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
- Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
- Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14 (7), 579-584 (1995).
- Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
- Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (10), 1879-1887 (1998).
- Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235 (1), 27-31 (1997).
- Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29 (6), 374-380 (1997).
- Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
- Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104 (10), 1670-1676 (1997).
- Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151 (5), 745-751 (2011).
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34 (34), 11504-11513 (2014).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (11), 2228-2233 (1996).
- Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93 (5), 634-637 (2009).
- Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17 (5), 4061-4073 (2009).
- Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1569-1574 (2015).
- Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88 (7), 723-729 (2010).
- Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11 (7), 0159650 (2016).
- Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93 (6), 439-445 (2015).
- Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49 (7), 1085-1096 (2004).
- Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124 (4), 433-446 (1997).
- Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25 (2016).
- Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129 (6), 728-733 (2000).
