Etichettatura fluorescente colorante di eritrociti e leucociti per studiare la dinamica del flusso nella circolazione retinica del mouse
Summary
L'imaging di cellule vascolari delle cellule ematiche in circolo oculare può fornire informazioni sull'infiammazione e l'ischemia nella retinopatia diabetica e nella degenerazione maculare legata all'età. Viene descritto un protocollo per etichettare le cellule del sangue e l'immagine delle cellule etichettate nella circolazione retinica.
Abstract
La dinamica del flusso sanguigno retinico e coroideo può fornire un'idea della fisiopatologia e delle sequele delle varie malattie oculari, come il glaucoma, la retinopatia diabetica, la degenerazione maculare legata all'età (AMD) e altre condizioni infiammatorie oculari. Può anche aiutare a monitorare le risposte terapeutiche nell'occhio. La corretta etichettatura delle cellule del sangue, accoppiata con l'imaging a cellule vive delle celle etichettate, consente di analizzare le dinamiche di flusso nella retina e nella circolazione choroidale. Qui descriviamo i protocolli standardizzati di etichettatura di indocyanina verde (ICG) di 1,5% e fluoresceina di sodio 1% rispettivamente degli eritrociti dei topi e dei leucociti. La scansione di oftalmoscopia laser (SLO) è stata applicata per visualizzare le cellule etichettate nella circolazione della retina dei topi C57BL / 6J (tipo selvatico). Entrambi i metodi hanno dimostrato distinte cellule etichettate con fluorescenza nella circolazione retinica del mouse. Questi metodi di etichettatura possono avere applicazioni più ampie in varie malattie oculariModelli.
Introduction
Studiare le dinamiche di flusso delle cellule del sangue nella circolazione retinica e choroidale è indispensabile per comprendere la patogenesi delle malattie oculari potenzialmente visibili e altre condizioni infiammatorie oculari. Tuttavia, le tecniche convenzionali di angiografia, che coinvolgono il legame dei coloranti fluorescenti alle proteine plasmatiche, non forniscono alcuna informazione relativa alla dinamica degli eritrociti o dei leucociti 1 . Le dinamiche di flusso della retina eritrocita sono importanti per studiare la circolazione metabolica efficiente nella retina e le dinamiche di flusso delle leucociti, per comprendere la migrazione cellulare, il riconoscimento, l'adesione e la distruzione in varie condizioni infiammatorie2. Ci sono diverse molecole fluorescenti utilizzate per l'identificazione e la caratterizzazione di vari tipi di cellule 3 . L'emodinamica delle cellule del sangue può essere misurata colorandoli con i fluorescenti appropriatiCentesimi e applicando le tecniche di imaging corrette 4 .
La presenza di risposte infiammatorie nelle malattie intraoculari, come la degenerazione maculare legata all'età (AMD) e la retinopatia diabetica (DR), comportano l'accumulo di linfociti nell'area affetta 5 , 6 . Il monitoraggio delle cellule immunitarie nei tessuti può aiutare a comprendere gli eventi complessi coinvolti nel meccanismo della patogenesi della malattia. Gli isotopi radioattivi come 51 Cr e 125 I sono stati usati come traccianti di cellule negli studi iniziali. Questi coloranti sono tossici e influenzano la vitalità cellulare. Anche se i marcatori radioattivi 3 H e 14 C sono meno tossici per le cellule, a causa delle loro energie di emissione minori, è difficile rilevare i loro segnali nel sistema 7 , 8 . Sono stati introdotti diversi coloranti fluorochromici per superare i potenziali problemi associatiIth marcatori radioattivi e migrazione linfocitaria in pista in vitro utilizzando microscopia fluorescente e citometria a flusso 9 , 10 . Hoechst 33342 e tiazolo arancione sono coloranti fluorescenti legati al DNA, che vengono usati per monitorare i linfociti in vivo. Hoechst 33342 si lega a regioni ricche di AT nel DNA, è membrana permeabile, mantiene i segnali fluorescenti per 2 – 4 giorni ed è resistente alla spegnimento 9 , 10 . Gli svantaggi di Hoechst 33342 e di tiazolo arancione sono l'inibizione della proliferazione linfocitaria 11 e la breve emivita, rispettivamente 9 .
Calcein-AM, fluoresceina diacetato (FDA), 2 ', 7'-bis (2-carbossietil) -5- (e-6) -carbossilfluoresceina, acetossimetil estere (BCECF-AM) Carbossiofluoresceina diacetato (CFDA) e 5- (e-6) -carbossilfluoresceina diacetato acetossimetil estere (CFDA-AM)Sono i coloranti fluorescenti citoplasmatici utilizzati per studi di migrazione dei linfociti. Tuttavia, FDA, CFDA e CFDA-AM hanno una ritenzione inferiore nelle cellule 9 . BCECF-AM riduce la risposta proliferativa e influenza la produzione di chimotassi e superossido 9 , 12 . Calcein-AM è un colorante fluorescente e utile per studi di migrazione linfocitaria a breve termine in vivo . Emette forti segnali fluorescenti, non interferisce con la maggior parte delle funzioni cellulari e mantiene i segnali fluorescenti fino a 3 giorni 12 , 13 . I fluoresceina isotiocianato (FITC) e il carbossiofluoresceina diacetato succinimidil estere (CFDA-SE) sono coloranti fluorescenti di accoppiamento covalente, utilizzati per studi di migrazione dei linfociti. FITC non ha alcun effetto sulla vitalità cellulare e ha una più forte affinità con linfociti B rispetto ai linfociti T 14 , 15 </sup>. I linfociti CFDA-SE etichettati possono essere monitorati in vivo per più di 8 settimane e fino a 8 divisioni cellulari 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocyanina perclorato), DiO (3,3'-dioctadecilossacarbocanina perchlorato), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 e PKH26 sono membrana- Inserendo coloranti lipocilici fluocalcificanti carbocyanina utilizzati per etichettare leucociti ed eritrociti. C18 Dil e DiO mostrano segnali più elevati quando incorporati nella membrana cellulare e sono relativamente non tossici 12 , 17 . Le cellule etichette PKH2, PKH3 e PKH26 presentano una buona ritenzione dei segnali fluorescenti con meno tossicità 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Tuttavia, PKH2 giù regola l'espressione CD62L e riduce la lunghezza Viabilità del mphocyte 23 .
La maggior parte degli studi sopra menzionati sono stati eseguiti per monitorare la migrazione e la proliferazione dei linfociti nelle linfatiche e studiare gli eritrociti etichettati nella circolazione non oculare. Esistono pochissimi studi applicando le tecniche di etichettatura per studiare le cellule del sangue nella circolazione oculare. L'applicazione dell'Otalmoscopia laser di scansione (SLO) ha un grande vantaggio nello studio delle cellule etichettate nella circolazione retinica e coroidale in vivo mediante angiografia del fundus 24 . Esistono diversi coloranti fluorescenti quali ICG, arancio acridina, FITC, fluoresceina di sodio e CFDA che vengono utilizzati per studiare le leucociti nella circolazione retinica da SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . La fototossicità e la cancerogenicità dell'acidino arancio 26 , 27 , l'interferenza di FITC con l'attività cellulare e il requisito di un agente di contrasto intravascolare per la risoluzione dei retini e dei vasi sanguigni coroidali limita la loro applicazione in esperimenti animali in vivo 29 . La fluoresceina di sodio e ICG non sono tossiche, approvate dalla Food and Drug Administration e sono sicure per le prove sugli esseri umani 32 , 35 . La maggior parte degli studi dinamici di flusso sono legati all'etichettatura dei leucociti o agli eritrociti e la sua visualizzazione nei vasi sanguigni retinici e coroidali 36 , 37 , 38 , 39 </sup>. Qui descriviamo un protocollo standardizzato di etichettatura ICG degli eritrociti, etichettatura di fluoresceina di sodio dei leucociti e monitoraggio delle cellule etichettate visualizzate nella circolazione retinica del mouse usando SLO.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiare l'emodinamica nella circolazione retinica e choroidale è fondamentale per comprendere la fisiopatologia di molte malattie oculari. La dinamica del flusso sanguigno nella circolazione retinica può essere studiata mediante tomografia ottica di coefficiente di Fourier-dominio (FD-OCT), flussografia laser speckle (LSFG) e ossimetria retinica. Sebbene questi metodi utilizzino approcci diversi per studiare il flusso sanguigno totale nella circolazione retinica 40 , <sup class=…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto di ricerca è stato finanziato sotto la concessione di New Investigator dal National Medical Research Council (NMRC), Singapore. La squadra apprezzerà la formazione di ricerca fornita al dottor Agrawal presso l'Istituto di Oftalmologia (IoO), Università di Londra (UCL) sotto il National Medical Research Council (NMRC) borse di studio per la ricerca estera dal novembre 2012 al ottobre 2014 sotto tutorato del prof. David Shima. Il dottor Agrawal ha acquisito il concetto e le competenze per l'etichettatura delle cellule e l'imaging in diretta nel laboratorio del dottor Shima. La squadra apprezzerà quindi la supervisione e la guida durante la borsa di formazione del prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh e il dott. Daiju Iwata.
Materials
| Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Microcentrifuge tubes 2mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Shaker incubator | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |
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