마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지
Summary
안구 혈액 순환에서 표지 된 혈액 세포의 라이브 셀 이미징은 당뇨 망막 병증 및 연령 관련 황반변 성의 염증 및 허혈에 대한 정보를 제공 할 수있다. 망막 순환에서 혈액 세포를 표지하고 표지 된 세포를 영상화하는 프로토콜이 기술되어있다.
Abstract
망막 및 맥락막 혈류 역학은 녹내장, 당뇨병 성 망막증, 연령 관련 황반변 성 (AMD) 및 기타 안구 염증성 질환과 같은 다양한 안구 질환의 병태 생리 및 후유증에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 눈의 치료 반응을 모니터하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표지 세포의 살아있는 세포 이미징과 결합 혈액 세포의 적절한 라벨링, 망막과 맥락 순환에 흐름 역학의 조사 수 있습니다. 여기에서 마우스 적혈구 및 백혈구의 1.5 % indocyanine green (ICG) 및 1 % sodium fluorescein 표지의 표준화 된 프로토콜을 각각 설명합니다. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO)는 C57BL / 6J 마우스 (야생형)의 망막 순환에서 표지 된 세포를 시각화하기 위해 적용되었습니다. 두 방법 모두 생쥐 망막 순환에서 특이 적으로 형광 표지 된 세포를 보였다. 이러한 표지 방법은 다양한 안구 질환에서 더 넓은 적용 범위를 가질 수 있습니다모델.
Introduction
망막 및 맥락막 순환에서 혈구의 유동 역학을 연구하면 잠재적으로 시력이 위협되는 안구 질환 및 기타 안구 염증성 질환의 병인을 이해하는 것이 필수적입니다. 그러나 혈장 단백질에 형광 염료를 결합시키는 기존의 혈관 조영술은 적혈구 또는 백혈구의 동력학에 관한 정보를 제공하지 않습니다 1 . 적혈구 망막 혈류 역학은 망막에서의 대사 적으로 효율적인 순환과 다양한 염증 조건에서 세포 이동, 인식, 부착 및 파괴를 이해하기위한 백혈구 유동 역학을 연구하는데 중요합니다 2 . 다양한 세포 유형 3 의 동정과 특성 규명에 사용되는 몇 가지 형광 분자가 있습니다. 혈액 세포의 혈류 역학은 적절한 형광으로 염색하여 측정 할 수 있습니다염료 및 적절한 이미징 기술 적용 4 .
연령 관련 황반변 성 (AMD)과 당뇨 망막 병증 (DR)과 같은 안구 질환에서 염증 반응의 존재는 병변에 림프구가 축적되는 것을 의미합니다 5 , 6 . 조직에서 면역 세포를 추적하면 질병 발병 기전과 관련된 복잡한 사건을 이해하는 데 도움이됩니다. 51 Cr과 125 I와 같은 방사성 동위 원소는 초기 연구에서 세포 추적자로 사용되었다. 이 염료는 독성이 있고 세포 생존 능력에 영향을줍니다. 방사성 마커 3 H와 14 C는 낮은 방출 에너지로 인해 세포에 덜 독성이 있지만 시스템 7,8 에서 신호를 검출하기가 어렵습니다. 여러 가지 형광 염료가 잠재적 인 문제를 극복하기 위해 도입되었습니다.i 방사능 마커 및 형광 현미경 및 유동 세포 계측법을 사용하여 체외에서 림프구 이동 을 추적 9,10 . Hoechst 33342와 thiazole orange는 DNA 결합 형광 염료이며, 생체 내에서 림프구를 추적하는데 사용됩니다 . Hoechst 33342는 DNA의 AT가 풍부한 영역에 결합하고, 막 투과성이며, 2 ~ 4 일 동안 형광 시그널을 유지하며 9 , 10 소실에 내성입니다. Hoechst 33342와 thiazole orange의 단점은 림프구 증식의 억제 11 과 짧은 반감기 9 입니다.
(FDA), 2 ', 7'- 비스 – (2- 카르복시 에틸) -5- (및 -6) – 카르복시 플루 오레 신, 아세 톡시 메틸 에스테르 (BCECF-AM), 5- (및 -6) (CFDA) 및 5- (및 -6) – 카르복시 플루 오레 신 디 아세테이트 아세 톡시 메틸 에스테르 (CFDA-AM)림프구 이동 연구에 사용되는 세포질 형광 염료입니다. 그러나 FDA, CFDA 및 CFDA-AM은 세포 내 보유력이 낮습니다 9 . BCECF-AM은 증식 반응을 감소시키고 주 화성 및 과산화물 생산에 영향을 미친다. Calcein-AM은 형광 염료이며 단기 생체 내 림프구 이동 연구 에 유용합니다. 그것은 강한 형광 신호를 방출하고 대부분의 세포 기능을 방해하지 않으며 최대 3 일 동안 형광 신호를 유지합니다 12 , 13 . Fluorescein isothiocyanate (FITC)와 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE)는 공유 결합 형광 염료이며 림프구 이동 연구에 사용됩니다. FITC는 세포 생존 능력에 영향을 미치지 않으며 T 림프구보다 B 림프구에 더 강한 친 화성을 갖는다 14 , 15 </sup>. CFDA-SE 표지 림프구는 8 주 이상 및 8 세포 분열 9 , 16 시간 동안 생체 내에서 추적 할 수 있습니다. C18 DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 및 PKH26은 막 – 백혈구 및 적혈구를 표지하기 위해 사용되는 형광 친 지성 카보시 아닌 염료를 삽입한다. C18 Dil과 DiO는 세포막에 결합 될 때 더 높은 신호를 나타내며 상대적으로 독성이 없습니다 12 , 17 . PKH2, PKH3 및 PKH26로 표지 된 세포는 독성이 적은 18 , 19 , 20 , 21 , 22 의 형광 신호를 잘 유지합니다. 그러나, PKH2는 CD62L 발현을 감소시키고 ly를 감소시킨다 림프구 생존율 23 .
상기 언급 된 대부분의 연구는 림프계에서 림프구 이동 및 증식을 추적하고 비 안과 순환에서 표지 된 적혈구를 연구하기 위해 수행되었다. 안과 순환에서 혈액 세포를 연구하기위한 표지 기술을 적용한 연구는 거의 없습니다. 주사 레이저 안검 내시경 (SLO)의 적용은 안저 혈관 조영술 24에 의한 생체 내 망막 및 맥락막 순환 에서 표지 된 세포를 연구하는데 큰 이점이 있습니다. SLG 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 30에 의해 망막 순환에서 백혈구를 연구하는데 사용되는 ICG, 아 크리 딘 오렌지, FITC, 나트륨 플루오 레세 인 및 CFDA와 같은 여러 가지 형광 염료가있다 .class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . acridine 오렌지의 광 독성과 발암 성 26 , 27 , 세포 활동과 FITC의 간섭, 망막과 맥락막 혈관의 해상도를위한 혈관 내 조영제의 요구 사항은 생체 내 동물 실험 29 그들의 응용 프로그램을 제한합니다. Sodium fluorescein 및 ICG는 식품 의약품 안전청 (Food and Drug Administration)의 승인을 얻은 무독성이며 인체 검사시 안전합니다 32 , 35 . 유동 역학 연구의 대부분은 백혈구 또는 적혈구의 표지 및 망막 및 맥락막 혈관에서의 시각화와 관련이있다 36 , 37 , 38 , 39 </s업>. 여기, 적혈구의 ICG 라벨링, 백혈구의 나트륨 fluorescein 라벨링, SLO를 사용하여 마우스 망막 순환에서 시각화 된 라벨 세포 추적 표준화 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
망막 및 맥락막 순환에서 혈류 역학을 연구하는 것은 많은 안구 질환의 병리 생리학을 이해하는 데 중요합니다. 망막 순환에서의 혈류 역학은 Fourier-domain optical coherence tomography (FD-OCT), laser speckle flowgraphy (LSFG) 및 망막 산소 측정법에 의해 연구 될 수있다. 이 방법은 망막 순환에서 총 혈류를 연구하기 위해 다른 접근법을 사용하지만 40 , 41 , <sup c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구 프로젝트는 싱가포르 국립 의료 연구 협의회 (National Medical Research Council, NMRC)의 New Investigator 기금으로 지원되었습니다. 연구팀은 2012 년 11 월부터 2012 년 10 월까지 National Medical Research Council (NMRC) 해외 연구 연수 펠로우 십을 통해 University University of London (UCL)의 안과 연구소 (IoO)에서 Agrawal 박사에게 제공 한 연구 훈련에 대해 감사를 표합니다. David Shima. Agrawal 박사는 시마 박사의 실험실에서 세포에 라벨을 붙이고 영상을 찍기위한 개념과 기술을 습득했습니다. 따라서 팀은 David Shima 교수, Kenith Meissner 박사, Peter Lundh 박사 및 Daiju Iwata 교수의 훈련 펠로우쉽 중 감독과지도를 인정하고자합니다.
Materials
| Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Microcentrifuge tubes 2mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Shaker incubator | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |
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