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Etiquetagem de corantes fluorescentes de eritrócitos e leucócitos para estudar a dinâmica do fluxo na circulação da retina do mouse

Published: July 03, 2017
doi:
10.3791/55495
, , , , ,
1National Healthcare Group Eye Institute,Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI),Singapore National Eye Center, 3School of Material Science and Engineering,Nanyang Technological University, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University Health Systems,National University of Singapore, 5Ophthalmology Academic Clinical Research Program,DUKE-NUS Graduate Medical School

Summary

A imagem em células vivas das células sanguíneas marcadas na circulação ocular pode fornecer informações sobre inflamação e isquemia na retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. É descrito um protocolo para rotular as células do sangue e imagem das células rotuladas na circulação da retina.

Abstract

A dinâmica da corrente retiniana e coroidal pode fornecer informações sobre a fisiopatologia e seqüelas de várias doenças oculares, como glaucoma, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD) e outras condições inflamatórias oculares. Também pode ajudar a monitorar as respostas terapêuticas no olho. A rotulagem adequada das células do sangue, juntamente com imagens de células vivas das células rotuladas, permite a investigação da dinâmica do fluxo na circulação retiniana e coróide. Aqui, descrevemos os protocolos padronizados de 1,5% de indocyanina verde (ICG) e 1% de marcação de fluoresceína de sódio de ratos eritrócitos e leucócitos, respectivamente. Foi aplicada a oftalmoscopia laser de varredura (SLO) para visualizar as células rotuladas na circulação da retina de camundongos C57BL / 6J (tipo selvagem). Ambos os métodos demonstraram células distintas marcadas fluorescentemente na circulação da retina do mouse. Estes métodos de rotulagem podem ter aplicações mais amplas em várias doenças ocularesModelos.

Introduction

Estudar a dinâmica do fluxo das células sanguíneas na circulação retiniana e coróide é imperativo para a compreensão da patogênese de doenças oculares potencialmente ameaçadoras de visão e outras condições inflamatórias oculares. No entanto, as técnicas de angiografia convencional, que envolvem a ligação de corantes fluorescentes a proteínas plasmáticas, não fornecem nenhuma informação sobre a dinâmica dos eritrócitos ou leucócitos 1 . A dinâmica do fluxo da retina dos eritrócitos é importante para estudar a circulação metabolicamente eficiente na retina e a dinâmica do fluxo de leucócitos, para entender a migração celular, reconhecimento, adesão e destruição em várias condições inflamatórias 2 . Existem várias moléculas fluorescentes usadas na identificação e caracterização de vários tipos de células 3 . A hemodinâmica das células do sangue pode ser medida por coloração com as fluorescências apropriadasCorantes centrais e aplicando as técnicas adequadas de imagem 4 .

A presença de respostas inflamatórias em doenças intraoculares como a degeneração macular relacionada à idade (AMD) e a retinopatia diabética (DR) envolvem a acumulação de linfócitos na área doente 5,6. O rastreamento das células imunes nos tecidos pode ajudar a compreender os eventos complexos envolvidos no mecanismo da patogênese da doença. Os isótopos radioativos como 51 Cr e 125 I foram utilizados como traçadores celulares em estudos iniciais. Esses corantes são tóxicos e afetam a viabilidade celular. Embora os marcadores radioativos 3 H e 14 C sejam menos tóxicos para as células, devido às suas energias de emissão mais baixas, é difícil detectar seus sinais no sistema 7 , 8 . Uma série de corantes de fluorochrome foram introduzidos para superar os problemas potenciais associados wIth marcadores radioativos e acompanhar a migração de linfócitos in vitro usando microscopia fluorescente e citometria de fluxo 9 , 10 . Hoechst 33342 e laranja de tiazol são corantes fluorescentes que ligam DNA, que são utilizados para rastrear linfócitos in vivo. O Hoechst 33342 liga-se a regiões ricas em AT no DNA, é permeável à membrana, mantém os sinais fluorescentes durante 2 a 4 dias e é resistente à extinção 9 , 10 . As desvantagens do Hoechst 33342 e da laranja de tiazole são a inibição da proliferação de linfócitos 11 e a meia-vida curta, respectivamente 9 .

Calcein-AM, diacetate de fluoresceína (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (e -6) -carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo (BCECF-AM), 5- (e -6) Diacetate de carboxifluoresceína (CFDA) e éster de acetoximetilo de ácido 5- (e -6) -carboxifluoresceína (CFDA-AM)São os corantes fluorescentes citoplasmáticos utilizados para estudos de migração de linfócitos. No entanto, FDA, CFDA e CFDA-AM têm menor retenção nas células 9 . BCECF-AM reduz a resposta proliferativa e influencia a produção de quimiotaxia e superóxido 9 , 12 . Calcein-AM é um corante fluorescente e útil para estudos de migração de linfócitos in vivo a curto prazo. Ele emite sinais fluorescentes fortes, não interfere com a maioria das funções celulares e retém sinais fluorescentes por até 3 dias 12 , 13 . O isotiocianato de fluoresceína (FITC) e o éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFDA-SE) são corantes fluorescentes de acoplamento covalente, que são utilizados para estudos de migração de linfócitos. FITC não exibe nenhum efeito sobre a viabilidade celular e tem maior afinidade com os linfócitos B do que os linfócitos T 14 , 15 </suP>. Os linfócitos marcados com CFDA-SE podem ser rastreados in vivo por mais de 8 semanas e até 8 divisões de células 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3-tetrametilindocarbocanina perclorato), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyanina perclorato), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 e PKH26 são membrana- Inserindo corantes de carbocyanina lipofílicos fluorescentes usados ​​para rotular leucócitos e eritrócitos. C18 Dil e DiO exibem sinais mais elevados quando incorporados na membrana celular e são relativamente não tóxicos 12 , 17 . As células marcadas com PKH2, PKH3 e PKH26 exibem uma boa retenção dos sinais fluorescentes com menos toxicidade 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . No entanto, o PKH2 regula a expressão CD62L e reduz-se Viabilidade de mphocyte 23 .

A maioria dos estudos acima mencionados foram realizados para rastrear a migração e proliferação de linfócitos no linfatismo e estudar os eritrócitos marcados na circulação não ocular. Existem poucos estudos aplicando as técnicas de rotulagem para estudar as células sanguíneas na circulação ocular. A aplicação de oftalmose de laser de varredura (SLO) tem uma grande vantagem ao estudar as células marcadas na circulação retiniana e coróide in vivo pela angiografia do fundo 26. Existem vários corantes fluorescentes, como ICG, laranja de acridina, FITC, fluoresceína de sódio e CFDA que são utilizados para estudar os leucócitos na circulação da retina por SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . A fototoxicidade e a carcinogenicidade da laranja de acridina 26 , 27 , a interferência da FITC com a atividade celular e a exigência de um agente de contraste intravascular para a resolução dos vasos sanguíneos retinianos e coroidais limitam sua aplicação em experiências com animais in vivo 29 . A fluoresceína de sódio e o ICG são não tóxicos, aprovados pela Food and Drug Administration e seguros para testes em seres humanos 32 , 35 . A maioria dos estudos dinâmicos de fluxo estão relacionados à rotulagem dos leucócitos ou eritrócitos e sua visualização nos vasos sanguíneos da retina e coróide 36 , 37 , 38 , 39 </sUp>. Aqui, descrevemos um protocolo padronizado de rotulagem ICG dos eritrócitos, marcação com fluoresceína de sódio dos leucócitos e rastreamento das células marcadas visualizadas na circulação da retina do mouse usando SLO.

Protocol

Os protocolos de animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal de SingHealth, em Cingapura e estão de acordo com as diretrizes da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o Uso de Animais em Oftálmica e Visão Pesquisa. 1. Rotulagem de eritrócitos e leucócitos com corantes fluorescentes Preparação de reagentes Prepare ICG (1,5 mg / mL) dissolvendo 3 mg de ICG em 1800 μL de água des…

Representative Results

Os eritrócitos marcados com ICG a 1,5% foram visualizados na circulação da retina de ratinhos C57BL / 6J (tipo selvagem). Tanto o hematócrito de 1% como o de 5% de eritrócitos marcados com ICG a 1,5% foram distinguíveis na circulação da retina. No entanto, as células rotuladas individuais foram mais claramente visualizadas com 1% de hematócrito de 1,5% de eritrócitos marcados com ICG ( Figura 1 ). Em 5% de hematócrito, devido ao grande número de…

Discussion

Estudar a hemodinâmica na circulação retiniana e coróide é vital para a compreensão da fisiopatologia de muitas doenças oculares. A dinâmica do fluxo sanguíneo na circulação da retina pode ser estudada por tomografia de coerência óptica de domínio de Fourier (FD-OCT), fluxografia de speckle laser (LSFG) e oximetria retiniana. Embora estes métodos utilizem diferentes abordagens para estudar o fluxo sanguíneo total na circulação da retina 40 , 41…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O projeto de pesquisa foi financiado pela bolsa do New Investigator do National Medical Research Council (NMRC), em Cingapura. A equipe gostaria de reconhecer o treinamento de pesquisa fornecido ao Dr. Agrawal no Instituto de Oftalmologia (IOO), University College London (UCL) sob a Associação de Treinamento de Pesquisa no Exterior do National Research Research (NMRC) de novembro de 2012 a outubro de 2014 sob orientação do Prof. David Shima. O Dr. Agrawal adquiriu o conceito e habilidades para rotular as células e imagens em vivo no laboratório do Dr. Shima. Por conseguinte, a equipe gostaria de reconhecer supervisão e orientação durante a bolsa de treinamento do Prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh e Dr. Daiju Iwata.

Materials

Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1
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Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).
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