JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Флуоресцентная маркировка красителей эритроцитов и лейкоцитов для изучения динамики потока в циркуляции сетчатки мышей

Published: July 03, 2017
doi:
10.3791/55495
, , , , ,
1National Healthcare Group Eye Institute,Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI),Singapore National Eye Center, 3School of Material Science and Engineering,Nanyang Technological University, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University Health Systems,National University of Singapore, 5Ophthalmology Academic Clinical Research Program,DUKE-NUS Graduate Medical School

Summary

Живые клетки меченых клеток крови при циркуляции глаз могут предоставить информацию о воспалении и ишемии при диабетической ретинопатии и возрастной макулярной дегенерации. Описан протокол для маркировки клеток крови и изображения меченых клеток в кровообращении сетчатки.

Abstract

Динамика сетчатки и хориоидального кровотока может дать представление о патофизиологии и последствиях различных глазных заболеваний, таких как глаукома, диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) и другие воспалительные состояния глаз. Это также может помочь контролировать терапевтические реакции в глазу. Надлежащая маркировка клеток крови, в сочетании с визуализацией живых клеток меченых клеток, позволяет исследовать динамику потока в сетчатке и хориоидальной циркуляции. Здесь мы описываем стандартизированные протоколы 1,5% индоцианинового зеленого (ICG) и 1% флюоресцеиновой метки для мышей эритроцитов мышей и лейкоцитов соответственно. Сканирующая лазерная офтальмоскопия (SLO) применялась для визуализации меченых клеток в ретинальном кровообращении мышей C57BL / 6J (дикого типа). Оба метода продемонстрировали различные флуоресцентно меченные клетки в циркуляции сетчатки мыши. Эти методы маркировки могут иметь более широкое применение при различных заболеваниях глазмоделей.

Introduction

Изучение динамики течения клеток крови в сетчатке и хориоидальной циркуляции необходимо для понимания патогенеза потенциально опасных для зрения глазных заболеваний и других глазных воспалительных состояний. Однако обычные методы ангиографии, которые связаны с связыванием флуоресцентных красителей с белками плазмы, не дают никакой информации о динамике эритроцитов или лейкоцитов 1 . Динамика потока сетчатки эритроцитов важна для изучения метаболически эффективной циркуляции в сетчатке и динамики потока лейкоцитов, для понимания миграции клеток, распознавания, адгезии и разрушения в различных воспалительных состояниях. Существует несколько флуоресцентных молекул, используемых при идентификации и характеристике различных типов клеток 3 . Гемодинамику клеток крови можно измерить, окрашивая их соответствующими флуоресценциямиИ применяя надлежащие методы визуализации 4 .

Наличие воспалительных реакций при внутриглазных заболеваниях, таких как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) и диабетическая ретинопатия (DR), включает накопление лимфоцитов в пораженной области 5 , 6 . Отслеживание иммунных клеток в тканях может помочь понять сложные события, связанные с механизмом патогенеза болезни. Радиоактивные изотопы, такие как 51 Cr и 125 I, использовались в качестве клеточных индикаторов в ранних исследованиях. Эти красители являются токсичными и влияют на жизнеспособность клеток. Хотя радиоактивные маркеры 3 H и 14 C менее токсичны для клеток, из-за их более низких энергий излучения трудно обнаружить их сигналы в системе 7 , 8 . Ряд флуорохромных красителей был введен для преодоления потенциальных проблем, связанных сС радиоактивными маркерами и миграцией трековых лимфоцитов in vitro с использованием флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии 9 , 10 . Hoechst 33342 и тиазол апельсин представляют собой связывающие ДНК флуоресцентные красители, которые используются для отслеживания лимфоцитов in vivo. Hoechst 33342 связывается с богатыми AT областями в ДНК, является мембранопроницаемой, сохраняет флуоресцентные сигналы в течение 2-4 дней и устойчив к тушению 9 , 10 . Недостатками Hoechst 33342 и тиазола оранжевого являются ингибирование пролиферации лимфоцитов 11 и короткий период полувыведения, соответственно 9 .

Кальцеин-AM, диацетат флуоресцеина (FDA), 2 ', 7'-бис- (2-карбоксиэтил) -5- (и -6) -карбоксифлуоресцеин, ацетоксиметиловый эфир (BCECF-AM), 5- (и -6) – Карбоксифлуоресцеиндиацетат (CFDA) и 5- (и -6) -карбоксифлуоресцеиндиацетат ацетоксиметиловый эфир (CFDA-AM)Являются цитоплазматические флуоресцентные красители, используемые для изучения миграции лимфоцитов. Однако FDA, CFDA и CFDA-AM имеют более низкое удерживание в клетках 9 . BCECF-AM снижает пролиферативный ответ и влияет на хемотаксис и продуцирование супероксида 9 , 12 . Кальцеин-AM – флуоресцентный краситель и полезен для краткосрочных исследований миграции лимфоцитов in vivo . Он излучает сильные флуоресцентные сигналы, не мешает большинству сотовых функций и сохраняет флуоресцентные сигналы на срок до 3 дней 12 , 13 . Флуоресцеиновый изотиоцианат (FITC) и карбоксифлуоресцеин-диацетатсукцинимидиловый эфир (CFDA-SE) представляют собой ковалентные связующие флуоресцентные красители, которые используются для изучения миграции лимфоцитов. FITC не оказывает влияния на жизнеспособность клеток и имеет более сильное сродство с В-лимфоцитами, чем Т-лимфоциты 14 , 15 </suр>. Маркированные лимфоциты CFDA-SE можно отследить in vivo в течение более 8 недель и до 8 клеточных делений 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианиновый перхлорат), DiO (3,3'-диоктадецилоксакарбоцианиновый перхлорат), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 и PKH26 являются мембранно- Вставляя флуоресцентные липофильные карбоцианиновые красители, используемые для маркировки лейкоцитов и эритроцитов. C18 Dil и DiO проявляют более высокие сигналы при включении в клеточную мембрану и относительно нетоксичны 12 , 17 . Меченые клетки PKH2, PKH3 и PKH26 демонстрируют хорошее удерживание флуоресцентных сигналов с меньшей токсичностью 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Однако PKH2 down регулирует экспрессию CD62L и уменьшает Жизнеспособность мфоцитов 23 .

Большинство вышеупомянутых исследований были проведены для отслеживания миграции и пролиферации лимфоцитов в лимфатических узлах и изучения меченых эритроцитов в неокрубальной циркуляции. Есть очень мало исследований, применяющих методы маркировки для изучения клеток крови в циркуляции глаз. Применение сканирующей лазерной офтальмоскопии (SLO) имеет большое преимущество при изучении меченых клеток в сетчатке и хориоидальной циркуляции in vivo андрогенологией дна. Существует несколько флуоресцентных красителей, таких как ICG, акридиновый апельсин, FITC, флюоресцеин натрия и CFDA, которые используются для изучения лейкоцитов в циркуляции сетчатки с помощью SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . Фототоксичность и канцерогенность акридинового апельсина 26 , 27 , интерференция FITC с клеточной активностью и потребность внутрисосудистого контрастного агента для разрешения сетчатки и сосудистых сосудов ограничивают их применение в экспериментах на животных in vivo 29 . Флюоресцеин натрия и МКГ нетоксичны, одобрены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами и безопасны для тестирования на людях 32 , 35 . Большинство динамических исследований потока связаны с маркировкой лейкоцитов или эритроцитов и его визуализацией в сетчатке и сосудистых сосудах 36 , 37 , 38 , 39 </sвверх>. Здесь мы описываем стандартизованный протокол маркировки ICG эритроцитов, флюоресцеиновую лейкоцитов натрия и отслеживание визуализированных меченых клеток в циркуляции сетчатки мыши с использованием SLO.

Protocol

Протоколы животных, используемые в этом исследовании, были одобрены Комитетом по гигиене и использованию животных SingHealth в Сингапуре и соответствуют рекомендациям Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологии и зрения Исследование. <p …

Representative Results

Эритроциты, помеченные 1,5% -ной МКГ, визуализировались в ретинальной циркуляции мышей C57BL / 6J (дикого типа). Как 1%, так и 5% гематокрит 1,5% ICG меченых эритроцитов были различимы в кровообращении сетчатки. Однако отдельные меченые клетки были более четко визуализированы с 1% ?…

Discussion

Изучение гемодинамики в сетчатке и хориоидальной циркуляции жизненно важно для понимания патофизиологии многих глазных заболеваний. Динамику кровотока в кровообращении сетчатки можно исследовать с помощью фурье-оптической когерентной томографии (FD-OCT), лазерной спекл-флюографии (LSFG…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследовательский проект финансировался по гранту New Investigator от Национального совета по медицинским исследованиям (NMRC), Сингапур. Команда хотела бы поблагодарить доктора Агравала в Институте офтальмологии (IoO), Университетского колледжа Лондона (UCL) в рамках Национального исследовательского совета по медицинским исследованиям (NMRC) за период с ноября 2012 года по октябрь 2014 года под руководством профессора Дэвид Шима. Доктор Агравал приобрел концепцию и навыки для маркировки клеток и визуализации в лаборатории доктора Шимы. Команда, таким образом, будет признавать надзор и руководство во время обучения стипендиатам от профессора Дэвида Шимы, профессора Кенита Мейснера, доктора Питера Лунда и доктора Дайю Ивата.

Materials

Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
  2. Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23 (5), 975-987 (2013).
  3. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  4. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
  5. Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58 (3), 353-363 (2006).
  6. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366 (13), 1227-1239 (2012).
  7. Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
  8. Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, (1978).
  9. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
  10. Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
  11. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  12. DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
  13. Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
  14. Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
  15. Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
  16. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
  17. Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
  18. Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
  19. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
  20. Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
  21. Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
  22. Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
  23. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  24. Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
  25. Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47 (6), 572-577 (2003).
  26. Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
  27. Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
  28. Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14 (7), 579-584 (1995).
  29. Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
  30. Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (10), 1879-1887 (1998).
  31. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235 (1), 27-31 (1997).
  32. Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29 (6), 374-380 (1997).
  33. Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
  34. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104 (10), 1670-1676 (1997).
  35. Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151 (5), 745-751 (2011).
  36. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
  37. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34 (34), 11504-11513 (2014).
  38. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
  39. Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (11), 2228-2233 (1996).
  40. Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93 (5), 634-637 (2009).
  41. Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17 (5), 4061-4073 (2009).
  42. Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1569-1574 (2015).
  43. Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88 (7), 723-729 (2010).
  44. Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11 (7), 0159650 (2016).
  45. Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93 (6), 439-445 (2015).
  46. Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49 (7), 1085-1096 (2004).
  47. Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124 (4), 433-446 (1997).
  48. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25 (2016).
  49. Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129 (6), 728-733 (2000).

Tags

ErythrocytesLeukocytesRetinal CirculationMouseFluorescent Dye LabelingICGSodium FluoresceinScanning Laser OphthalmoscopeBlood Cell Flow DynamicsRetinal Diseases
check_url/pt/55495?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image