Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

voorbereiding en Published: May 2, 2017 doi: 10.3791/55567
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1, 1
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

Summary

Dit manuscript beschrijft de efficiënte, niet-virale aflevering van miR aan endotheelcellen door een PEI / MNP vector en de magnetisatie. Dus behalve genetische modificatie, deze benadering voor magnetische cellen leiding en MRI detecteerbaarheid. De techniek kan worden gebruikt om de kenmerken van de therapeutische cel producten te verbeteren.

Abstract

Tot op heden, de beschikbare chirurgische en farmacologische behandelingen voor hart- en vaatziekten (HVZ) zijn beperkt en vaak palliatieve. Tegelijkertijd, gentherapie, celtherapie zijn veelbelovende alternatieve benaderingen voor CVD behandeling. Echter, de brede klinische toepassing van gentherapie sterk beperkt door het gebrek aan geschikte gen-afgiftesystemen. De ontwikkeling van geschikte genafleveringsvectoren kan een oplossing voor de huidige problemen in cel therapie. Met name bestaande nadelen, zoals beperkte efficiëntie en lage retentietijd van cellen in het beschadigde orgaan, kunnen worden overwonnen door geschikte cel techniek (dwz genetische) vóór transplantatie. De gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte en veilige tijdelijke modificatie van endotheelcellen behulp polyethyleenimine superparamagnetische magnetische nanodeeltjes (PEI / MNP) gebaseerde afleverende vector. Ook het algoritme en werkwijzen voor cellulaire karakterisatie gedefinieerd. De succesvolle intracellular levering van microRNA (miR) in humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) is verwezenlijkt zonder dat cellevensvatbaarheid, functionaliteit of intercellulaire communicatie. Bovendien werd deze aanpak blijkt een sterke functionele effect geïntroduceerde exogene miR veroorzaken. Belangrijk is dat de toepassing van deze MNP-gebaseerde vector verzekert cel magnetisatie, met bijbehorende mogelijkheden magnetische targeting en niet-invasieve MRI tracing. Dit kan als basis voor het magnetisch geleid genetisch gemanipuleerde cellen therapeutica die niet-invasief kan worden gevolgd met MRI te verschaffen.

Introduction

Gene en celtherapie zijn krachtige instrumenten die de potentie heeft om de huidige uitdagingen in de CVD behandeling op te lossen hebben. Ondanks het feit dat beide benaderingen worden momenteel getest in klinische studies, zijn ze nog niet klaar voor brede klinische toepassing 1. Met name een gemeenschappelijke benadering van de uitdagingen van gen- en celtherapie te pakken is om multifunctionele genafgifte vectoren die geschikt zijn voor klinische toepassing te ontwikkelen. Het gebrek aan veilige en efficiënte genafgifte systemen is de belangrijkste zorg van gentherapie. Tegelijkertijd, de genetische manipulatie van cellulaire producten voorafgaand aan transplantatie de grote uitdagingen van celtherapie, zoals lage efficiëntie (bijvoorbeeld in het cardiale gebied slechts ~ 5% functionele verbetering wordt bereikt na stamceltransplantatie 1 kon overwinnen ) en slechte retentie / implantatie op de plaats van letsel (dat wil zeggen, daalt celretentie dan 5-10% binnen minuten tot uren post-toepassing, ongeacht de toedieningsweg 2, 3, 4).

Tot op heden virale vectoren aanzienlijk overschrijdt niet-virale systemen qua efficiëntie, wat heeft geleid tot bredere toepassing in klinische trials (~ 67%) 5. Echter, virale vehikels dragen ernstige risico's, zoals immunogeniteit (en de daaropvolgende ontstekingsreactie met ernstige complicaties), oncogeniciteit, en beperkingen van de omvang van de uitgevoerde genetisch materiaal 6. Vanwege deze veiligheidsproblemen en de hoge kosten van virale vectorproductie, het gebruik van niet-virale systemen de voorkeur in bepaalde gevallen 7, 8. Het is bijzonder geschikt voor kwalen die transiënte genetische correctie vereisen, zoals de expressie van groeifactoren regelen van angiogenese (bijvoorbeeld voor CVD behandeling) of delivery van vaccins.

In onze groep werd een afgiftesysteem gemaakt door combineren van 25-kDa vertakte polyethyleenimine (PEI) en superparamagnetische ijzeroxide nanopartikels (MNP) gebonden door biotine-streptavidine interactie 9. Deze vector is een potentieel middel voor de genetische manipulatie van cellen, waardoor het gelijktijdig magnetisatie voorafgaand aan transplantatie. Laatstgenoemde vormt een basis voor magnetische geleiding / retentie, die bijzonder veelbelovend tegenwoordig geavanceerde magnetische targeting technieken met succes ontwikkeld 10. Bovendien is de resulterende magnetisch responsieve cellen hebben het potentieel om niet-invasief bewaakt door magnetische resonantie beeldvorming (MRI) of magnetische deeltjes imaging 11, 12.

Bij de PEI / MNP vector, polyamine zorgt nucleïnezuur condensatie en dus bescherming tegen verval factor s, vector internalisatie in cellen en endosomale ontsnappen 5. De MNP aanvulling op de eigenschappen van PEI, niet alleen qua magnetische geleiding, maar ook door het verminderen van de toxiciteit bekende PEI 7, 13, 14. Voorheen werden PEI / MNP vector eigenschappen qua afgifterendement (dwz pDNA en miRNA) en veiligheid bepalen door fibroblasten en menselijke mesenchymale stamcellen 15, 16.

In dit manuscript wordt een gedetailleerd protocol over de toepassing van PEI / MNP's voor het genereren van miRNA-gemodificeerde cellen 17 beschreven. Hiertoe worden gebruikt HUVECs en een gevestigd model voor in vitro angiogenese vertegenwoordigen. Ze zijn moeilijk te transfecteren en zijn gevoelig voor toxische invloed 18, 19,ass = "xref"> 20. Bovendien geven we een algoritme voor dergelijke cellen in vitro, waaronder het richten, intercellulaire communicatie en MRI detectie evalueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Human navelstrengen voor mobiele isolatie werden postpartum verkregen van op de hoogte, gezonde vrouwen die hun schriftelijke toestemming voor het gebruik van dit materiaal voor onderzoek gaf in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. De ethische commissie van de Universiteit van Rostock heeft de gepresenteerde studie (reg. Nr A 2011 06, verlengde 23 september 2013) goedgekeurd.

1. Bereiding van transfectiecomplexen

  1. Biotinylering van polyethyleenimine (PEI).
    1. Dissolve vertakt PEI in ultrazuiver water onder magnetisch roeren bij 300-400 rpm gedurende 24 uur bij kamertemperatuur (RT) en beschermd tegen licht een 0,18 mM oplossing te verkrijgen. Bewaar de oplossing bij 4 ° C.
    2. Meet de concentratie van primaire aminogroepen in de verkregen oplossing 21, 22.
      1. Met 2% ninhydrine reagensoplossing als detectiereagens amine 23 door het mengen van 100 ui prediluted monster (1: 200 met ultrazuiver water) en 75 pi van ninhydrinereagens. Incubeer gedurende 30 minuten bij 80 ° C. Koel het neer en voeg 100 ul van 50% ethanol om te stabiliseren. Meet de absorptie bij 550 nm van de absorptie spectrofotometer.
      2. Een standaardcurve met behulp glycine.
        1. Bereid 0,1 M amino-N voorraadoplossing (0,75 g glycine in 100 ml gedeïoniseerd water) en de verdunningen 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 100, 1: 200 en 1: 400, 1: 600. Meet deze oplossingen zoals in stap 1.1.2.1 en een plot van de concentratie en absorptie op de assen.
        2. Op basis van de verkregen grafiek en de gemeten absorptie van de PEI-oplossing, definieert de concentratie van de α-aminogroepen in PEI.
          LET OP: Let op. Ninhydrine reagensoplossing worden uitsluitend onder de motorkap en onder stikstof worden bewaard. Het is niet bruikbaar wanneer de kleur van de oplossing verandert als gevolg van oxidatie.
    3. Los 100 mg biotine linker in ultrazuiver water onmiddellijk voor gebruik om een ​​0,01 mM oplossing te verkrijgen. Bereken de benodigde hoeveelheid biotine PEI te voegen door de concentratie van α-aminogroepen in PEI (gemeten in stap 1.1.2) te vermenigvuldigen met 20 de benodigde hoeveelheid te verkrijgen (in mol) biotinyleringsmiddel reagens.
      1. Voeg het biotine oplossing van het PEI oplossing bij pH 8-9 en incubeer gedurende 16 uur onder magnetisch roeren bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder het gereageerde biotine door grootte-uitsluitingschromatografie 23. In de handel verkrijgbare kolommen met een gelfiltratie medium geschikt voor de zuivering van het 25-kDA PEI en de instructies van de fabrikant. Neem porties na zuivering de amineconcentratie meten met een amine detectiereagens (stap 1.1.2) en het biotine conjugatie efficiëntie (stap 1.2.2) te bepalen. Bewaar de verkregen gebiotinyleerd PEI bij 4 ° C.
  2. Karakterisering van gebiotinyleerde PEI.
    1. Het gehalte aan α-aminogroepen in PEI na biotinylering, zoals beschreven in stap 1.1.2.
    2. Bepaal de mate van PEI biotinylering aan de vervoeging procedure te controleren. Voor kwantificering, een in de handel verkrijgbare kit, die is gebaseerd op de toepassing van HABA kleurstof (4'-hydroxyazobenzene-2-carbonzuur), de juiste colorimetrische bepaling van de biotinylering niveaus 24, 25 te waarborgen. Volg de instructies van de fabrikant.
  3. Filtratie van MNP's en hun karakterisering.
    1. Filter de handel verkrijgbaar met streptavidine beklede MNP door een 0,45 urn spuit-aangedreven filter 16 om grotere toxische aggregaten sluiten. Meet de uiteindelijke ijzerconcentratie behulp van een standaard fotometrische bepaling 26.
    2. Onderzoek de kwaliteit van de gefilterde MNP door opnamede magnetisatie kromme en met TEM beeldvorming volgens standaard protocollen 27, 28.
      1. Verdun het MNP suspensie met gedestilleerd water en plaats 3 pl van de verkregen suspensie op een 300-mesh Formvar-koolstof beklede koperen rooster voor TEM analyse. Vervolgens zet dit raster op een glasplaatje op een verwarmingsplaat en laat het drogen.
      2. Analyseer het monster met een transmissie-elektronenmicroscoop bij 120 kV en elementaire inhoud te controleren met behulp van een röntgendetector 27.
  4. 3-color labeling van transfectiecomplexen voor superresolutietechnieken.
    1. Label 0,5% van de gemeten primaire aminogroepen in PEI met NHS-Ester Atto 488 kleurstof volgens de instructies van de fabrikant. Verwijdert de overmaat ongebonden kleurstof door grootte-uitsluitingschromatografie, zoals hierboven beschreven (stap 1.1.4) beschreven. Meten van de resulterende concentratie van aminogroepen met behulp van een ninhydrine assay (stap 1.1.2).
    2. Label commercieel verkrijgbaar gecodeerde miR (SCR-miR) met Cyanine5 kleurstof met een geschikte labeling kit 15 (aangeduid in het Materials List). Meet de resulterende fluorofoor-miR concentratie spectrofotometrisch.
    3. Vers labelen MNP telkens met biotine geconjugeerd kleurstof (bijvoorbeeld atto 565-biotine) bij een 1: 1000 w / w verhouding. Direct op de kleurstof na toevoeging van het MNP de miR / PEI tijdens de vorming van de transfectie complexen volgens de gegevens in Delyangina et al. 16.

2. Celbereiding

  1. HUVEC isolement.
    1. Isoleer cellen uit de navelstreng direct na het verkrijgen van de koorden via collagenase uit het inwendige van het koord ader; volgt een eerder ontwikkelde protocol 29.
      1. Incubeer elk koord bij -60 eenheden / ml collagenase type IV oplossing in buffer - in t geladenHij navelstrengader - bij 37 ° C gedurende 13 min.
    2. Voor alle experimenten, zwembad de HUVECs van een minimum van 5 patiënten.
      LET OP: De teelt mag niet meer dan 4-5 passages. Niet gebruikte cellen besmet met mycoplasma, omdat dit veroorzaakt een afname in transfectie-efficiëntie. Mycoplasma verontreiniging worden getest voordat het protocol met behulp van een PCR kit voor de zeer gevoelige detectie van mycoplasma.
      1. Test voor mycoplasma aanwezigheid.
        1. Centrifugeer 1 mi van celcultuur supernatant gedurende 10 min (13.000 x g). Suspendeer de pellet in 17 ul van dH 2 O en kookt (93 ° C) gedurende 3 min. Gebruik 2 pi van de suspensie aan het DNA amplificeren die codeert voor sterk geconserveerde ribosomale RNA (16S-rRNA) van verscheidene mycoplasma species.
        2. Voer de PCR met behulp van 10 pmol van elke primer (forward primer: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 ', reverse primer: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') in combinatie met een commerciële kit PCR onder de volgende omstandigheden: 94 ° C gedurende 3 min; 45 cycli van 94 ° C gedurende 30 s, 50 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 30 s; en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
        3. Analyse van het PCR product (292 bp) met behulp van agarosegelelektroforese.
    3. Ofwel opslaan van de verkregen cellen op lange termijn in vloeibare stikstof of kweek ze in het endotheel groeimedium aangevuld met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer met 5% CO2.
  2. HUVEC karakterisering.
    1. Karakteriseren geïsoleerd HUVECs wat betreft hun functionele vermogen om buizen in de basaalmembraan matrix (bv Matrigel) bouwen en de expressie van de endotheliale merker CD31 (bloedplaatje endotheliale celadhesiemolecule, PECAM-1) volgens standaardprotocollen 30, 31.

3. Transfectie

  1. Trypsinize de voorraad HUVEC cultuur (zie stap 4.1.2.) En handmatig de cellen met behulp van een hemocytometer tellen. Zaad de HUVECs op plastic celkweek putsplaten geschikte grootte, met een uitgaande celdichtheid van ongeveer 13.000 cellen / cm2 oppervlaktegroei, 48 uur voor transfectie tot 70-80% confluentie wordt bereikt.
  2. Bereid verse miR / PEI / MNP complexen elke keer.
    OPMERKING: Ten eerste moet miR / PEI-complexen worden verkregen (stappen 3.2.1 - 3.2.3); vervolgens MNP's worden op de miR / PEI-oplossing (stap 3.2.4) om de uiteindelijke miR / PEI / MNP samenstelling voor transfectie (stap 3.3) te krijgen toegevoegd.
    1. Bereken de hoeveelheid geschikte commercieel verkrijgbare miR (gebakken, gekoppeld of functionele, stap 4) met de concentratie van de voorraadoplossing van de fabrikant. Gebruik 2,5 pmol miR / cm2 celkweekoppervlak. Verdun de miR in 5% glucoseoplossing voor obtain een uiteindelijke concentratie van 0,125 pmol miR / ul.
    2. Gebaseerd op de miR hoeveelheid uit stap 3.2.1 en de optimale verhouding van 25 NP 32, berekent de benodigde hoeveelheid PEI met behulp van de gemeten concentratie (stap 1.1.2). Verdun de PEI (volgens de berekende vereiste volume) in een gelijk volume van 5% glucoseoplossing. Voeg de verkregen verdunde pre-PEI de miR-oplossing (uit stap 3.2.1) en vortex het verkregen mengsel gedurende 30 s.
    3. Incubeer de verkregen miR / PEI mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Ultrasone trillingen de MNP's op 35 kHz gedurende tenminste 20 minuten in het soniceren waterbad (zie Materials List) bij kamertemperatuur, voeg de juiste hoeveelheid MNP oplossing voor de miR / PEI (5-25 ug ijzer / ml bereid miR / PEI / MNP mengsel 16), vortex gedurende 30 s en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur tot klaar.
  3. Voeg de bereide miR / PEI / MNP mengsel werd druppelsgewijs direct aan het kweekmedium op de cellen. Met het verkregen mengsel cel culture medium met miR / PEI / MNP verdund in glucose als de transfectie-oplossing. Vervang dit mengsel vers kweekmedium 6 h na transfectie.

4. Analyse van Vector Safety

  1. Onderzoek van de levensvatbaarheid van de cellen.
    1. Transfecteren HUVECs gezaaid in een 24-well plaat cultuur (stappen 3.1 en 3.2); Gebruik Cy3-miR de meetpennen en gecodeerde miR (SCR-miR) als controle gating probes voor flowcytometrie. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer die 5% CO2 gedurende 24 uur.
    2. Verzamel de supernatant en getransfecteerde cellen door trypsinisatie behulp 1x trypsine-EDTA verdund in PBS aan de cellen toegevoegd gedurende 4 minuten bij 37 ° C. Centrifugeren bij 300 g gedurende 10 min en gebruikt voor de analyse.
    3. Onderzoekt cellevensvatbaarheid en miR opname-efficiëntie 24 uur na transfectie met flowcytometrie door een commercieel beschikbare beits onderscheid te maken tussen levende / dode cellen; gebruik van standaard protocollen 15
  2. Onderzoekt de veiligheid van de miR / PEI / MNP complexen cellen in functionele assays.
    1. Evalueer de proliferatie activiteit van getransfecteerde cellen.
      1. Transfecteren HUVECs uitgezaaid in een 12-putjes kweekplaat (stappen 3.1 en 3.2) met functionele antisense miR (bijvoorbeeld anti-miR92a voor HUVECs 31) en incubeer bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer die 5% CO2 gedurende 24 uur.
      2. Een in de handel verkrijgbare kit voor het aantal prolifererende cellen definiëren door kleuring met EDE (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) en scannen met laser gebaseerde confocale microscopie. Gebruik de volgende microscopie instellingen: 40x objectief met olie-immersie; 633-nm excitatie laser (een 647-nm kleurstof); 5 willekeurige velden op te nemen in elk monster. Bereken het percentage prolifererende cellen door het aantal EDU-gekleurde kernen gedeeld door het totaal aantal kernen (Hoechst gekleurd).
    2. Evalueer het vermogen van getransfecteerde cellen tot buisachtige structuren, zoals eerder beschreven 17, 31.
      1. Transfecteren HUVECs uitgezaaid in een 24-putjes kweekplaat (stappen 3.1 en 3.2) met SCR-miR en incubeer gedurende 48 uur bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer met 5% CO2. Verzamel de getransfecteerde cellen (zoals in stap 4.1.1).
      2. Zaad 3,5 x 10 4 van gemodificeerde HUVECs in 24-putjesplaten bekleed met 140 pl basaalmembraanmatrix. Incubeer gedurende 18 uur bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer met 5% CO2.
      3. Neem beelden van 10 willekeurige velden in elk putje met behulp van laser scanning confocale microscopie (differentieel interferentie contrast) en te analyseren met behulp van ImageJ software met de "Angiogenese Analyzer" plugin. Omvat parameters zoals de totale lengte van takken, het aantal vertakkingen en het aantal junctions in de evaluatie. Vergelijk dit met de onbehandelde controle.
  3. Nagegaan toxische invloed van transfectiecomplexen op gap junction (GJ) gemedieerde intercellulaire communicatie (GJIC) door het testen 3D fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP) 33 in 3D.
    1. Zaad de cellen op glazen objectglaasjes gelatine bekleed met een dunne bodem geschikt voor levende cellen beeldvorming (olie onderdompeling). Transfecteren cellen zoals hierboven beschreven in stap 3.2 met niet-gelabeld, niet-functionele miR (SCR-miR) en incubeer gedurende 24 uur.
    2. Bereid de cellen voor de beeldvorming door ze met direct calceïne voor microscopie. Met name Vervang het kweekmedium door vers medium bevattende 5 uM calceïne, incubeer gedurende 20 minuten, wassen met PBS, en voeg vers kweekmedium. Voorverwarmen van de incubator van de microscoop 37 ° C en pas de CO2 concentratie 5%.
      OPMERKING: Alle reagentia moeten warm naar cel contrac vermijdentie voor de meting.
    3. Met een 561-nm excitatie laser voor celvisualisatie en FRAP experiment. Ten eerste, handmatig cellen voor meting als gebieden van belang (ROI) te selecteren; testcellen ten minste 3 aangrenzende cellen. Definieer een referentiecel met heldere, stabiele fluorescentie die niet worden gebleekt. Bepalen de grenzen van een z-stack. Noteer de fluorescentie van de bovenkant van de cellen aan de bodem 10 onder - 15 lagen.
    4. Bleek de testcellen met 100% laservermogen en noteer de daaropvolgende fluorescentieherstel (door GJ-specifieke kleurstofoverdracht van naburige cellen) gedurende de volgende 15 minuten. Noteer de ruwe gegevens in de z-stacks elke 60 s. In totaal Voer de FRAP metingen met ten minste 5-10 testcellen per experiment. Vergelijk de resultaten aan ongetransfecteerde cellen.

5. Het testen van transfectie-efficiëntie

  1. Onderzoek van miR-opname.
    1. Bereid de probes zoals beschreven in step 4.1 en gebruik ze gelijktijdig miR opname te definiëren met flowcytometrie.
  2. Bevestigen en beschrijven intracellulaire lokalisatie van transfectiecomplexen met confocale en superresolutie gestructureerde verlichting microscopie (SIM).
    1. Zaad de HUVECs op met gelatine beklede dekglaasjes geplaatst in de putjes van 24-putjes, zoals eerder beschreven (stap 3.1). Transfecteren cellen met 3 kleuren gemerkte miR / PEI / MNP (stap 1.4) en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer met 5% CO2.
    2. Was de dekglaasjes eerst met 2% runderserumalbumine (BSA) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en daarna met alleen PBS. Fix cellen door incubatie in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 37 ° C gedurende 15 min en vlek kernen met DAPI na standaardprotocollen 16. Was 3 maal op het schudapparaat (15 minuten elk) om overmaat kleurstof te verwijderen.
      OPMERKING: PFA is kankerverwekkend en moet zorgvuldig worden behandeld.
    3. Plaats de prepared dekglaasjes op objectglaasjes met geschikte fixeermiddel, laten drogen minimaal 1 uur en deze voor microscopie, zoals hieronder beschreven.
    4. Het verwerven van beelden met behulp van een 63x olie-immersie objectief en de volgende SIM instellingen: 405-, 488-, 561- en 633-nm laser lijnen voor excitatie; z-stack mode met een 32-bits diepte hoeken 5, 5 fasen, met middeling van 4; G2 rooster met een 405 laserlijn, G3 met 488, G4 met 561 en G5 met 633.
  3. Evalueer de functionaliteit van de geleverde miR met RT-qPCR in miR / PEI / MNP-HUVECs versus onbehandelde.
    1. Transfecteren HUVECs uitgezaaid in een 12-putjes kweekplaat trappen (3.1 en 3.2) met functionele antisense miR (bijvoorbeeld anti-miR92a voor HUVECs 31) en incubeer gedurende 48 uur bij 37 ° C in een bevochtiger ceerde atmosfeer met 5% CO2.
    2. Evalueer de anti-miR92a levering en behandelen met RT-qPCR behulp van commercieel verkrijgbare kits (zie materialen); volgen thij instructies van de fabrikant, zoals elders 17, 31 beschreven. Tegelijkertijd onderzoekt de expressie van het doelgen (bijvoorbeeld ITGA5 31).
      OPMERKING: AntagomiR afgifte tegen endogeen miR voorkeur boven imiteert aangezien daarmee het meten van de werkelijke uitkomst van de miR en niet alleen de intracellulaire accumulatie.

6. Cel Targeting Evaluatie en Magnetic Cell Separation

  1. Celgericht in statische omstandigheden in vitro.
    1. Transfecteren HUVECs in een plaat met 24 putjes (2,5 pmol / cm2 scr-miR, NP 25 en 15-25 ug / ml MNP), incubeer gedurende 24 uur, wassen en verzamel zoals hierboven beschreven (stap 4) beschreven.
    2. Meng de celpellet verkregen uit 1 goed met 1 ml vers kweekmedium en plaats deze in de putjes van een 12-wells plaat. Bevestig een kleine magneet plaatselijk (aan de zijkant) aan de onderzijde van de plaat met tape.
    3. Incubeer de celsuspensie gedurende 24 uur en observeer de celhechting en groei in de ruimte boven de magneet en in het gebied zonder een magneet. Een kwalitatieve evaluatie Een conventionele omgekeerde microscoop.
  2. Celgericht in gesimuleerde dynamische omstandigheden in vitro.
    1. Transfecteren HUVECs in een 24-wells plaat per stappen 3.1 en 3.2 (2,5 pmol / cm2 Cy3-miR, NP 25 en 15-25 gg / ml MNP), incubeer gedurende 24 uur, wassen en verzamel door trypsinisatie behulp 1x trypsine-EDTA in PBS verdund toegevoegd aan de cellen gedurende 4 minuten bij 37 ° C. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min.
    2. Meng de celpellet verkregen uit 1 goed met 1 ml vers kweekmedium en plaats deze in de put van een 12-wells plaat. Bevestig een kleine magneet plaatselijk (aan de kant van een put) met tape. Plaats de petrischaal op het schudapparaat en incubeer de celsuspensie gedurende 12 uur bij 150 tpm tot 34 dynamische omstandigheden te simuleren.
    3. Was de cellen en reparerenze met behulp van 4% PFA. Vlekken op de kernen met DAPI 16. Noteer de celhechting met behulp van laser scanning confocale microscopie met een 514-nm excitatie laser, z-stack mode (5-12 segmenten) voor ruwe data en maximale intensiteit beeldprojectie bewerking zijn om beelden voor analyse te maken.
  3. Kwantitatieve analyse van magnetisch reagerende en niet-reagerende cellen.
    1. Transfecteren HUVECs in een plaat met 24 putjes (2,5 pmol / cm2 scr-miR, NP 25 en 15-25 ug / ml MNP), incubeer gedurende 24 uur, wassen en verzamel zoals eerder beschreven (stap 6.2.1) . Pre-warm PBS en celsortering buffer (gesteriliseerd door filtratie, zie Materials List) tot 37 ° C. Resuspendeer de celpellet verkregen uit elk putje met 500 ui buffer celsortering.
    2. Gelden deze celsuspensie aan een magnetisch door de toegevoerde vaste magneet sorteren kolommen, was de kolommen op de magneet 3 keer met verse celsortering buffer en verzamel de doorloop als Magnetitisch reagerende fractie (MAG).
    3. Verwijder de kolommen uit de magneet en direct verzamelen van de magnetisch responsieve celfractie (mag +) door op verse celsortering buffer door de kolom met een plunjer.
    4. Centrifugeer zowel mag- en mag + bij 300 xg gedurende 10 min. Resuspendeer de celpellet in PBS, de cellen te tellen en cellevensvatbaarheid geëvalueerd met Trypan blauw exclusie test 35. Met de verkregen celpellet ofwel voor langetermijnanalyse (dwz, re-zaad en evalueren na 24, 48 en 72 h in kweek 17) of rechtstreeks voor flowcytometrie (trap 4.1.).
  4. Definieer de ijzeren laden van de getransfecteerde cellen.
    OPMERKING: Bij de bereiding dient elk contact van de cel probes met ijzeroxide materialen en instrumenten worden vermeden.
    1. Verzamel de getransfecteerde en ongetransfecteerde HUVECs controle (zoals in stap 4.1.1). Was de verzamelde cellen tweemaal in 2% BSA in PBS 36b y zorgvuldig mengen van de cellen met 1 ml van de wasbuffer en centrifugeren bij 300 xg gedurende 10 min. Resuspendeer de verkregen celpellet in 250 ui PBS, 100 ul 4% PFA en incubeer gedurende 20 minuten om cellen te repareren. Was 3 maal met PBS zoals hierboven beschreven.
    2. Resuspendeer de resulterende vaste celpellet in 110 ui PBS en overgebracht naar 100 gl PCR buizen.
      1. Neem 10-ul aliquots voor celtelling en gebruik het resterende monster magnetisch spectroscopie (MPS).
    3. Voer de meting op een in de handel verkrijgbare MPS-apparaat. Tijdens de meting worden de volgende instellingen: magneetveld rijden = 25 mT en frequentie f0 = 25 kHz. Ijzer kwantificering van de monsters, normaliseren de derde harmonische A3 van de MPS-spectrum tot de overeenkomstige A3, ref MNP een referentiemonster met bekende ijzeren hoeveelheid van 2,1 ugxref "> 37. Gebruik onbehandelde cellen als controle.

7. definiëren MRI detectielimieten

  1. Cell voorbereiding.
    1. Zaad HUVECs in een 6-wells plaat en transfecteren (2,5 pmol / cm2 scr-miR, NP 25 en 15-25 gg / ml MNP) in duplo of drievoud in overeenstemming met de vereiste hoeveelheid cellen (voor phantom voorbereiding). Incubeer de cellen gedurende 24 uur en wassen, te verzamelen en te monteren met 4% PFA, zoals eerder beschreven (stap 4).
    2. Tel de cellen verkregen, bereiden monsters met geschikte aantal cellen (bijvoorbeeld 10 3, 10 4, 10 5, etc.) en hun volume op 50 pl.
  2. Agarose phantom voorbereiding
    1. Bereid verschillende lagen van 2% agarose in 50 ml buizen met verschillende hoeveelheden getransfecteerde cellen ingebed tussen de lagen 38. Tijdens de voorbereiding, ultrasone trillingen en centrifuge de hete agarose 38 totvernietigen luchtbellen die artefacten veroorzaken.
      Opmerking: Het is belangrijk dat fantomen die 5,5 x 10 5 HUVEC behandeld met niet-magnetische miR / PEI-complexen worden bereid op dezelfde wijze te dienen als controles.
  3. Scan de in vitro fantomen met 7,1 T dier MRI-systeem na plaatsing van het fantoom midden van de spoel parallel aan de z-as van het magneetveld.
    1. Gelden de volgende reeks parameters voor een gradiënt-echo sequentie verwerving: TR = 66 ms; TE1 / TE 2/3 TE / TE 4 / TE 5 / TE 6 = 1,44 / 2,88 / 4,51 / 6,11 / 7,60 / 9,01 ms; kantelhoek = 3 °; matrix = 128 x 128 geïnterpoleerde tot 256 x 256; gezichtsveld = 42 mm; 100%; gemiddelde = 1, echotrein lengte = 1; plakdikte = 1,5 mm; en 16 segmenten.
    2. Beoordeelt het verval van het signaal van alle vier echotijden en bereken R2 * kaarten (R2 * = 1 / T2 *) met behulp van geschikte software, zoals elders beschreven 39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hoofddoel van de voorgestelde protocol magnetisch responsieve miR-gemodificeerde cellen en hun nauwkeurige karakterisering (figuur 1) te voeren. Hierdoor efficiënt getransfecteerde cellen, reagerend op magnetische selectie en begeleiding en detecteerbaar met MRI, worden verkregen.

Ten eerste, de identiteit van geïsoleerde HUVEC's werden bevestigd door typische kleuring met endotheliale merker CD31 (PECAM) (figuur 2A) en door hun vermogen om buizen op de juiste basaalmembraanmatrix (figuur 2B) te vormen. De verkregen cellen nam de miR ingevoerd bij PEI / MNP zeer efficiënt; microscopie toonde dat alle cellen waren positief voor een signaal van gemerkte miR (Cy3) 24 uur na transfectie (Figuur 3A). Belangrijk is dat er geen celdood opgenomen in vergelijking met onbehandelde cellen (Figuur 3B) en normale uiterlijk werd gehandhaafd (Figuur 3A). Zoals waargenomen met confocale laser scanning microscopie werd het signaal van Cy3-miR zich hoofdzakelijk in de cellen. Bovendien werd een nader onderzoek naar de intracellulaire lokalisatie van alle delen van de vector en transfectie miR met hogere resolutie onder toepassing van 3-color gemerkte complexen uitgevoerd. SIM, miR, PEI en MNP signalen werden allemaal gedetecteerd in het cytoplasma in de perinucleaire regio (Figuur 3C).

Verder is een gedetailleerd onderzoek van transfectievector veiligheid heeft aangetoond dat miR / PEI / MNP-HUVECs kunnen vormen buizen op de juiste basaalmembraanmatrix en het resulterende netwerk is vergelijkbaar met die van onbehandelde cellen gebruikt als positieve controle (Figuur 4A ). Bovendien getransfecteerde cellen die GJIC, zoals 3D-FRAP experimenten aangetoond. Vooral wanneer de cellen beladen met fluorescerende GJ-Permeable kleurstof en een van hen is gebleekt, de fluorescentie herstelt vanwege de verbinding met naburige cellen en de resulterende kleurstofoverdracht (figuur 4B).

Belangrijker nog, door de aanwezigheid van de superparamagnetische verbinding 40 (figuur 5A), PEI / MNP applicatie maakt niet alleen celtransfectie, maar ook de gelijktijdige magnetisatie. De verkregen hoeveelheid intracellulair ijzer werd gemeten met MPS (Figuur 5B) voor alle toegepaste MNP concentraties binnen het optimale bereik (2,5 pmol / cm2 miR; NP 25 aangevuld met 5-25 ng / mL MNP): 0,37 ± 0,079-0,7 ± 0.150 pg ijzer / cel 17. Aangezien het gebruik van magnetische scheidingskolommen gedemonstreerd al deze MNP concentraties de hoeveelheid magnetisch responsieve cellen in de totale hoeveelheid getransfecteerde cellen ~ 70% (figuur 5C). Bovendien, getransfecteerd HUVECs zichtbaar MRI (Figuur 5D) in in vitro agarose fantomen, nabootsen muis weefsel gevoeligheid. Bovendien is de magnetische targeting van getransfecteerde HUVEC's in dynamische omstandigheden gesimuleerd in vitro werd bewezen efficiënt (figuur 6) zijn. In deze experimentele opstelling, heeft ook de constante krachtige beweging kweekmedium geen belemmering heersende celgroei in het gebied nabij magneettoepassing.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische weergave van de productie van Magnetische miR-gemodificeerde HUVECs en hun analyse. De PEI / MNP (polyethyleenimine superparamagnetische nanodeeltjes gebaseerde vector /) toegepast op microRNA (miR) leveren aan humane navelstrengader endotheelcellen (HUVEC). Het verkregen celproduct wordt gekenmerkt door de volgende parameters: veiligheid (inclusief cellevensvatbaarheid, functioneleliteit en capaciteit voor intercellulaire communicatie); transfectie-efficiëntie (dwz miR opname-efficiëntie en de functionaliteit achteraf); magnetische targeting in vitro statische en gesimuleerde dynamische omstandigheden; magnetische resonantie beeldvorming (MRI) detectie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Karakterisatie van geïsoleerde HUVEC. A. representatief beeld van geïsoleerde en gekweekte HUVECs gekleurd met endotheliale CD31 marker. De kernen worden tegengekleurd met DAPI (blauw). De schaalbalk is 20 urn. B. Representatieve resultaten van de vaatvorming assay uitgevoerd op geïsoleerde HUVECs; het beeld is opgenomen met een laser scanning confocale microscoop (differentiële interferentie contrast) 18 uur na het zaaien van cellen op basaalmembraanmatrix. De schaalbalk is 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. miR Levering aan HUVECs met behulp van PEI / MNP. A. De opname van gemerkte miR (Cy3, rood) 24 uur na transfectie (2,5 pmol / cm2 Cy3-gemerkte miR, NP 25 en MNP 25 ug / ml) en de handhaving van normale cellen uiterlijk geïllustreerd. Beelden werden genomen met confocale laser scanning microscopie onder gebruikmaking van een 514 nm-excitatie laser (Cy3, rood) en differentiële interferentie contrast. De schaalbalk is 50 urn. B. cellevensvatbaarheid 24 uur na transfectie werd bepaald door flow cytometrie. De plot geeft de resultaten verkregen voor HUVECs behandeld met de volgende complexe samenstellingen: 2,5 pmol / cm2 Cy3-miR; NP-verhouding 25 aangevuld met 5 tot 25 ug / ml MNP's. De balken tonen de verhouding tussen het gemiddelde aantal levensvatbare cellen en de gehele celpopulatie (n = 6; foutbalken: SEM). C. gestructureerde verlichting microscopie (SIM) beeldvorming van 3-kleur gelabelde miR / PEI / MNP complexen door HUVEC's genomen. De cellen werden getransfecteerd zoals hierboven is beschreven, geïncubeerd en gefixeerd 24 uur na de behandeling; de kernen werden tegengekleurd met DAPI. Ruwe simgegevens werden in z-stacks en verwerkt; de representatieve beelden het resultaat zijn van de maximale intensiteit projectie. De volgende excitatie lasers toegepast: 405 nm (DAPI, blauw), 488 nm (Atto488-PEI, sinaasappel), 565 nm (Atto565-MNP, cyaan) en 633 nm (Cy5-miR, red). De schaalbalk is 5 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. De veiligheid van HUVECs modificatie met miR / PEI / MNP. A. Een buisvorming werd uitgevoerd met getransfecteerde cellen (2,5 pmol / cm2 SCR-miR, NP 25 en MNP 25 ug / ml) 48 uur na behandeling. Beelden werden verworven met een laser scanning confocale microscoop (dat wil zeggen differentiële interferentie contrast) 18 uur na het zaaien van cellen op basaalmembraanmatrix. HUVECs getransfecteerd met miR / PEI werden gebruikt als toxiciteitscontrole en onbehandelde cellen als een positieve controle. De schaalbalk is 100 urn. De grafiek geeft de verhouding tussen de getransfecteerde HUVECs en de onbehandelde cellen met behulp van verschillende parameters: buislengte, aantal vertakkingen en knooppunten (n = 3, foutbalken: SEM). B. De gap-junction gemedieerde intercellulaire communicatie van miR / PEI / MNP-gemodificeerde HUVECs werd beoordeeld 24 uur na transfectie. Hiertoe werden de geladen met GJ doorlatende kleurstof calceïne (oranje); fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP) werd in 3D onderzocht door scanning testcellen in z-stacks. Representatieve beelden van calceïne-beladen cellen voor het bleken direct na het bleken en 15 min na het bleken (met teruggewonnen fluorescentie) afgebeeld. De schaalbalk is 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Cel Magnetization Als gevolg van transfectie met PEI / MNP en de toepassing ervan. A. representatief beeld van gefilterde MNP, genomen met TEM, ter illustratie van hun geclusterde morfologie. Een kleine grootte (~ 5-15 nm) van één ijzeroxidedeeltjes (resulterend in superparamagnetisme) daardoorbevestigd. De schaalbalk is 100 nm. B. De intracellulaire belading van getransfecteerde cellen werd beoordeeld door magnetisch spectroscopie (MPS) 24 uur na transfectie. Het representatief panel toont de MPS spectrum van onderzochte monsters. Vooral zuivere MNP suspensie (50 pl) diende als referentie (blauwe vierkantjes); de cirkels MPS spectra van beide getransfecteerde celmonsters (rode cirkels: MNP 25 ug / ml, groene cirkels: MNP 5 ug / ml), terwijl de grijze driehoekjes geven de gedetecteerde achtergrondspectrumschatting verkregen door een meting zonder monster. Let op de logaritmische schaal van de amplitude (A). C. De hoeveelheid magnetisch gemodificeerde cellen werd gekwantificeerd door toepassing van getransfecteerde HUVEC (2,5 pmol / cm2 miR; NP 25 aangevuld met 5-25 ng / ml MNP), door trypsinisatie 24 uur na de behandeling verzameld, een magnetische celscheidingskolom. De resulterende magnetisch positieve fractie (dat wil zeggen, dat in de kolom bleef)werd geteld en het percentage van de totale hoeveelheid van getransfecteerde cellen wordt gereflecteerd op perceel per MNP concentratie (rode driehoekjes). Cellevensvatbaarheid werd vervolgens onderzocht door Trypan blauw exclusie test (grijze ruiten). De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM (n = 3). D. Een beeld illustratief MRI van getransfecteerde HUVECs (300.000 cellen; 2,5 pmol / cm2 miR; NP 25 en 25 ug / ml MNP) ingebed in een agarose fantoom werd opgenomen met een 7,1 T dier MRI-systeem. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 6
Figuur 6. In vitro Magnetic Targeting van miR / PEI / MNP-HUVECs in gesimuleerde dynamische omstandigheden. HUVECs werden verzameld 24 uur post-transfecterenion (2,5 pmol / cm2 Cy3-miR; NP 25 en MNP 25 ug / ml) en opnieuw geënt in vers kweekmedium in wells, met een magneetje lokaal bevestigd aan de zijwand. Op zijn beurt, was dit kweekplaat bevestigd aan een draaiende schudinrichting bij 150 rpm. Celhechting en groei werden 12 uur later geëvalueerd door het fixeren cellen met PFA, kleuren hun kernen met DAPI en uitvoeren van laser scanning confocale microscopie (excitatie laser: 405 nm, DAPI, blauw, 514 nm, Cy3, oranje). Representatieve beelden tonen celgroei in het gebied met magneet toepassing; zonder magneetoplegging; en in het midden van de kweekput, waarbij de vloeistofstroom werd concentreren van de cellen. De schaalbalken 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De productie van genetisch gemanipuleerde cellen geladen met superparamagnetische nanopartikels voor de verdere magnetisch gestuurde geleiding heeft in het huidige protocol. De succesvolle toepassing van deze strategie maakt het mogelijk voor de oplossing van een aantal problemen van celtherapie, zoals lage retentie en slechte innesteling in de gewonde gebied 2, 3, 4, door middel van een richtbare cel product voor transplantatie. Bovendien kon de gelijktijdige invoering van een juist gekozen genetisch materiaal cel eigenschappen te bevorderen en kan dus functionele voordelen 41 te verhogen.

Het huidige protocol is ontwikkeld op HUVECs als model. Deze cellen zijn bekend moeilijk te transfecteren en gevoelig voor toxische invloed 18, 19, 20 te zijn. de demonstrated niveau van fluorofoor-gelabelde miR opname meer dan 95% na PEI / MNP transfectie wordt gewoonlijk verkregen met PEI-gebaseerde vectoren en algemeen gebruikte kationische lipide-gebaseerde transfectie reagentia (bijvoorbeeld Lipofectamine) 42. Bovendien is de optimale verhouding van NP 25 overeen met eerder gepubliceerde waarden van 20-40 voor NP. Niettemin heeft de zeer efficiënte opname van geteste fluorofoor gemerkte miR geen garantie voor een goede miR verwerking en functie na de bevalling 43. Dit punt is bijzonder belangrijk in het geval van PEI met zijn strakke elektrostatische condensatie van NA. Zo mag de resulterende functionele capaciteit van miR geleverd worden getest. Hier een functionele miR endogeen tot expressie in HUVEC, miR-92a 31, werd geselecteerd, en anti-miR daartegen werd geleverd met behulp van PEI en PEI / MNP. Daardoor wordt een nagenoeg volledige knockdown van het doel miR-92a bleek een efficiënte afgifte van het anti-miR from de transfectie complexen.

Belangrijker in eerdere werken, de succesvolle toepassing van de PEI / MNP vector werd aangetoond voor de afgifte van plasmide DNA (pDNA) en miR andere celtypen, zowel hechtende (bijvoorbeeld COS7, menselijke mesenchymale stamcellen 15, 16) en suspensie (bijvoorbeeld, beenmerg afgeleide CD133 + hematopoietische stamcellen 44). Al deze experimenten hebben het bekende feit dat de transfectie-efficiëntie en toxiciteit zijn soort-afhankelijke cel 45 bevestigd. Zo is de keuze van de optimale vector samenstelling (dat wil zeggen, miR hoeveelheid, NP-verhouding en hoeveelheid ijzer MNP) worden uitgevoerd voor elk specifiek celtype verrichten volgens eerder vastgestelde optimale condities als referentiepunten.

Bovendien moet de voorbijgaande aard van de bereikte genetische modificatie worden verantwoord. Aan de ene kant, it is zeer geschikt voor bepaalde functiegroepen, zoals korte termijn afgifte van groeifactoren. Anderzijds, kan de duur van expressie niet lang genoeg voor verschillende doeleinden die langdurige expressie duren. Niettemin de bewezen veiligheid van de PEI / MNP vector steunt eventuele herhaalde toediening wanneer de omstandigheden verder worden geoptimaliseerd.

PEI en derivaten daarvan worden algemeen gebruikt vanwege hun hoge efficiëntie in vergelijking met andere niet-virale vehikels en zij gemakkelijker modificatie 7. Ondanks PEI succes in vitro en in vivo, zijn toepassing in klinische proeven is zeer beperkt (dat wil zeggen, enkele fase 1 en 2 trials of kankerpatiënten) 7, 14 vanwege toxiciteit PEI 7, 13. Zoals eerdere werken van onze groep 16, evenals dit protocol, hebben aangetoond, MNPzijn in staat om PEI toxiciteit aanzienlijk dalen. In het bijzonder heeft miR / PEI transfectie beschadigde het vermogen van HUVECs buizen vormen op hun matrix, waardoor een belangrijke functionele in vitro test voor deze cellen niet. Daarentegen vaatvorming uitvoering van miR / PEI / MNP-HUVECs was vergelijkbaar met onbehandelde cellen. Met name deze daling van PEI toxiciteit werd bereikt door geringe bestanddelen zoals ijzeroxide, welke biocompatibel en routinematig gebruikt als contrast reagens bij mensen 40 zijn.

Afgezien van functionele eigenschappen handhaven, is het belangrijk dat gemodificeerde cellen kan aantonen intercellulaire communicatie, aangezien deze eigenschap noodzakelijk is voor een goede integratie van de therapeutische cel na transplantatie 46. Daarnaast kunnen gemodificeerde cellen worden benut als dragers voor de afgifte van therapeutische miR om gewonde weefsels 47. In dit geval, hun capacity moleculen uit met naburige cellen bepaalt hun succes als drager. Aangezien PEI / MNP transfectie maakt GJIC in gewijzigde HUVECs, hebben ze het potentieel voor integratie in vivo en miR levering aan beschadigde gebieden.

Met name, zijn eerder gepubliceerd werk op mobiele magnetisatie voor toekomstige targeting de cel belading van ~ 4 en 30 ug ijzer / cel 48, 49, 50, 51 gemeld. Deze aantallen aanzienlijk hoger zijn dan de waarden ~ 0,16-0,7 pg / cel, die voldoende is voor de in vitro targeting van NA / PEI / MNP-HUVECs in statische en gesimuleerde dynamische omstandigheden waren. Dergelijke lage hoeveelheden ijzer zijn voordelig wat betreft veiligheid: een algemeen bekend mechanisme van ijzeroxide-nanodeeltjes geassocieerde toxiciteit (dat wil zeggen, de productie van reactieve zuurstof species (ROS)) bekend is direct gekoppeld aan de hoeveelheid internalized 40 nanodeeltjes. Bovendien hebben verscheidene studies aangetoond dat hoge intracellulaire niveaus van ijzeroxide nanodeeltjes kunnen leiden tot dosisafhankelijke cytoskelet desorganisatie en beschadigingen 52, 53. Belangrijk is dat de meeste gemelde gevallen van cel magnetisatie voor het richten doeleinden omvatten niet de genetische manipulatie van de cel. In tegenstelling tot de miR / PEI / MNP vector biedt de mogelijkheid om gelijktijdig cellen aan te passen en de magnetische eigenschappen toe te voegen.

Echter mogelijk bijna MNP lading niet voldoende magnetische targeting in een turbulente omgeving met bloedstroom. Om dichter bij de uitdagende in vivo situatie komen, werden dynamische omstandigheden gesimuleerd in vitro: kweekplaten met gemagnetiseerd miR / PEI / MNP-HUVECs in suspensie werden op de roterende schudder 34 geplaatst. Dit experiment kan duidelijk niet alle interacties die plaatsvinden invivo. Echter, het heeft geleid tot een beter begrip van de targeting mogelijkheden van PEI / MNP-gemodificeerde cellen. Als gevolg hiervan werd zeer efficiënte cel targeting aangetoond wanneer zelfs actief schudden van het kweekmedium had geen invloed op de beweging van cellen in de richting van de magneet 54. Hiervoor werden miR-gemodificeerde HUVECs beladen met ten minste ~ 0,16 pg ijzer / cel. Bovendien kunnen magnetisch responsieve cellen worden gesorteerd. Een cel scheidingsprocedure magneet gebaseerde toegepast op de huidige studie niet de levensvatbaarheid van de miR / PEI / MNP-cellen aangetast. Belangrijk is dat de toepassing van een statisch magnetisch veld (dat wil zeggen, gericht op experimenten die de toepassing van een magnetisch veld voor 12 betrokken - 24 uur) niet schadelijk effect op gerichte cellen. Derhalve toonde de productie van gemagnetiseerde genetisch gemodificeerde cellen vormt de basis voor verdere in vivo studies naar de efficiëntie van celretentie verzekerd door magneetkracht. Met name, the meest succesvolle in vivo onderzoeken waarin het doelwit gemagnetiseerde cellen 51, 54, 55 gebruikte mobiele retentie na plaatselijke toediening in plaats van de cel begeleiding na intraveneuze injectie. Daarom magneet gebaseerde retentie op de plaats van injectie wenselijk lijkt voor verdere in vivo toepassingen van miR / PEI / MNP-gemodificeerde cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben geen concurrerende financiële belangen te onthullen.

Acknowledgments

We willen graag G. Fulda (Electron Microscopy Center, Rostock University, Duitsland) bedanken voor de technische ondersteuning bij het verwerven van TEM beelden van gefilterde superparamagnetische nanodeeltjes en in het uitvoeren van hun X-stralen analyse. De werkzaamheden op de RTC Rostock gedragen werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs en Onderzoek Duitsland (FKZ 0312138A, FKZ 316159 en VIP + 03VP00241) en de Staat Mecklenburg-Voor-Pommeren met de EU-structuurfondsen (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 en ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) en de DFG (DA 1296-1), de Damp-Foundation en de Duitse Hartstichting (F / 01/12). Frank Wiekhorst werd gesteund door de EU FP7 onderzoeksprogramma "NanoMag" FP7-NMP-2013-GROOT-7.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEI 25 kDa Sigma Aldrich 408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101 Containing Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Reagent solution 2% Sigma Aldrich 7285
Glycine Sigma Aldrich 410225
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005
Microplate reader Model 680 Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Z5481
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 µm
Libra 120 transmission electron microscope Zeiss Acceleration Voltage 120 kV
Sapphire X-ray detector EDAX-Amatek
Cell culture plastic TPP
NHS-Esther Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-31
NHS-Esther Atto 488  ATTO-TEC GmbH AD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kit Mirus Bio MIR 9650
Biotin Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-71
Collagense Type IV Gibco Thermo Scientific 17104019
Endothelial growth medium, EGM-2 Lonza CC-3156 & CC-4176
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific 15140122 100 U/mL, 100 µg/mL
Matrigel BD Biosciences 356234
anti-PECAM-1 antibody Santa Cruz sc-1506
MS MACS columns Miltenyi Biotec  130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Scientific L10119
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control Thermo Scientific AM17120 "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript
Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control  Thermo Scientific AM17110 "scr-miR" in the manuscript
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor  Thermo Scientific AM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 4% solution in PBS
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306
NucleoSpin RNA isolation Kit Machery-Nagel 740955
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Scientific AM1560
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4366596
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4368814
hsa-miR-92a TaqMan assay Thermo Scientific 000431 Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready Mix Nippon Genetics LS27
ITGA5 TaqMan assay Thermo Scientific Hs01547673_m1
RNU6B TaqMan assay Thermo Scientific 001093
18S rRNA Endogenous Control Thermo Scientific 4333760F
Gelatin Sigma Aldrich G7041
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
PBS Pan Biotech P04-53500
BSA Sigma Aldrich
MACS buffer Miltenyi Biotec  130-091-221
Agarose Sigma Aldrich A9539
7.1 Tesla animal MRI system Bruker Corporation A7906
ImageJ software National Institutes of Health upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS device Bruker Biospin
Matlab software Mathworks
Ring Neodym Magnet  magnets4you GmbH RM-10x04x05-G ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Scientific C10340
FluorSave Reagent Merck 345789
Ultrasonic bath Bandelin electronic Type: RK 100 SH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  3. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
  4. Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
  5. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
  6. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27 (2012).
  7. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
  8. Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  9. Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
  10. Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
  11. Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
  12. Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
  13. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
  14. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023 (2016).
  15. Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  16. Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
  17. Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
  18. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  19. Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
  20. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  21. Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
  22. Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
  23. Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
  24. Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23 (1965).
  25. Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
  26. Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
  27. Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
  28. Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159 (2015).
  29. Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
  30. Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30 (2009).
  31. Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
  32. Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
  33. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  34. Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
  35. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
  36. Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
  37. Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
  38. Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
  39. Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
  40. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
  41. Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85 (2008).
  42. Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
  43. Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184 (2015).
  44. Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
  45. Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
  46. Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
  47. Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
  48. Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
  49. Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
  50. Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
  51. Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149 (2013).
  52. Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
  53. Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
  54. Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  55. Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).

Tags

Geneeskunde endotheelcellen de engineering miRNA polyethyleenimine magnetische nanodeeltjes targeting MRI
voorbereiding en<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering van Magnetische miR-gemodificeerde endotheelcellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, … More

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, F., Kühn, J. P., Frank, M., Steinhoff, G., David, R. Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (123), e55567, doi:10.3791/55567 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter