Summary
Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der langen Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophile Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode. Dies ist eine neue Methode, die zum ersten Mal die Quantifizierung und Charakterisierung der Glutamin und Asparagin Desamidierung Isoformen von Shotgun Proteomics ermöglicht.
Abstract
Charakterisierung von Protein Deamidierung ist zwingend notwendig, die Rolle (n) und Möglichkeiten dieses Proteins posttranslationalen Modifikation (PTM) in der menschlichen Pathologie und anderen biochemischen Zusammenhänge zu entschlüsseln. Um Charakterisierung von Protein Deamidierung durchzuführen, haben wir vor kurzem eine neue lange Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode, die den Glutamin (Gln) und Asparagin (Asn) Isoform trennen kann Produkte der Desamidierung von Modellverbindungen zu sehr komplexen biologischen Proben. LERLIC-MS / MS ist daher die erste Schrotflinte Proteomik Strategie für die Trennung und Quantifizierung von Gln Desamidierung Isoformen. Wir zeigen auch, wie ein Novum, dass die Probenverarbeitungsprotokoll skizziert hier stabilisiert das Succinimid zwischen dessen Charakterisierung ermöglicht durch LERLIC-MS / MS. Die Anwendung von LERLIC-MS / MS, wie in diesem Video-Artikel gezeigt kann helfen, die derzeit unknow aufzuklärenn molekulare Arrays von Protein Desamidierung. Darüber hinaus bietet LERLIC-MS / MS weitergehendes Verständnis der enzymatischen Reaktionen, die Desamidierung in verschiedenen biologischen Hintergründen umfassen.
Introduction
Desamidierung ist ein Protein posttranslationale Modifikation (PTM) , die eine negative Ladung an das Proteinrückgrat durch Modifikation von Asparagin (Asn) und / oder Glutamin (Gln) die Reste 1 einführt. Diese Modifikation während Asn - Reste beeinflussen erzeugt das isomeren Produkte Isoasparaginsäure (Isoasp) und n -Asparaginsäure (Asp) an einem gemeinsamen Verhältnis 3: 1 2. Dessen ungeachtet kann dieses Verhältnis durch das Eingreifen des Reparaturenzym L-Isoaspartyl methyltransferase (PIMT) 3, 4 verändert werden. In ähnlicher Weise erzeugt Deamidierung von Gln - Reste die isomeren gamma-Glutaminsäure (γ-Glu) und alpha-glutaminsäure - Isoformen (α-Glu) bei einem erwarteten 1: 7 Verhältnis 3, 5, aber dieses Verhältnis kann durch die Wirkung der verschoben werden das ubiquitäre Enzym Transglutaminase 2 und andere Transglutaminasen, einschließlich Transglutaminase 1, wird eine Enzyme kürzlich mit extrazellulären Vesikeln im Gehirn 6 als assoziiert identifiziert.
Der Ursprung der Desamidierung kann entweder spontan oder enzymatisch sein, ist das erstere besonders häufig auf Gln - Resten , bei denen Transglutaminasen und anderen Enzyme vermitteln inter / intramolekulare Vernetzung über Umamidierung (siehe 3 für weitere Details über Gln Umamidierung und ihre Auswirkungen in einigen chronischen und tödliche Krankheiten beim Menschen). Daher ist Desamidierung ein PTM , die eine entscheidende Auswirkung auf die Struktur und Funktion der betroffenen Moleküle 4, 7, 8 und erfordert eine eingehende chemische Charakterisierung 3 im Lichte ihrer unterschiedlichen biochemischen Konsequenzen einschließlich der Dienst als molekulare Uhr hat 9 des Alterns .
Obwohl Deamidierung von Asn-Reste hat relativ gut charakterisierte von unten nach oben shotgun Proteomics 1, 10, Deamidierung von Gln - Resten immer noch nicht eine geeignete Charakterisierungsmethode über die anspruchsvolle Analyse von Modellverbindungen , die durch elektronen basierend hat radikale Fragmentierungs 11. Wir haben vor kurzem eine neue eindimensional Shotgun Proteomics Strategie (LERLIC-MS / MS) 3 , die Trennung von Gln und Asn Desamidierung Isoformen von komplexen biologischen Proben und Modellverbindungen in einer einzigen Analyse ermöglicht. LERLIC-MS / MS basiert auf der Trennung von tryptischen Peptiden verdaute eine lange Länge (50 cm) Ionenaustauschersäule (LAX) arbeitet auf elektrostatische Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung-Chromatographie (Erlić) Modus und mit dem Tandem-Massenspektrometrie (LC- MS / MS). Diese neue analytische Strategie wurde verwendet, um das Ausmaß jeder deamidiertes Rückstand in menschlichen Hirngewebe zu charakterisieren und relativ zu Quantifizierenf "> 3. Dennoch skizzierte das Protokoll hier wird Video - Imaging von LERLIC-MS / MS abzielen , die Besonderheiten von Protein Desamidierung im biochemischen Zusammenhang von Interesse zu studieren.
ETHIK STATEMENT
Alle Verfahren dieses Protokolls wurden von der Institutional Review Board der Nanyang Technological University in Singapur und wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts genehmigt.
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Protocol
1. Packen der Lang Länge Anionen-Austausch (LAX) Kapillarsäule
(Anmerkung: Obwohl die LAX Spalte in-home sein kann , verpackt , wie wir in diesem Protokoll beschreiben, LAX Spalten sind auch im Handel erhältlich, siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für weitere Details).
- Suspend 50 mg schwacher Anionenaustauschfüllmaterial in 3,5 ml Packungspuffer (Tabelle 1) , um die Aufschlämmung herzustellen.
- Montieren Sie das Ende der Kapillarsäule (Länge 50 cm - 200 & mgr; m Innendurchmesser (ID) Schlauch) mit einer weiblich-zu-männlich Fitting, eine ferule und eine weibliche Schraubenmutter. Platzieren eine Bildschirm 1/16" OD von 1 Mikrometer Porengröße innerhalb des weiblich-zu-Negativ-Paßelement. (Anmerkung: Der Bildschirm hier verwendet wurde, haben muß kleinere Porengröße als die Partikelgröße des Füllmaterials zu verhindern, dass eine Leckage des Materials aus dem Säule).
- Packen die Kapillare mit der Aufschlämmung eine Druckpumpe bei 4.500 psi betrieben wird. (Hinweis: Packen Sie die coluMn, bis das Verpackungsmaterial ist am Eingang der Säule) sichtbar.
- Montieren Sie das andere Ende der Kapillarsäule wie unter Punkt 1.2 beschrieben.
2. Probenvorbereitung
Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von LERLIC-MS / MS menschliche Hirngewebe als Modell Proteom zu analysieren. (Hinweis: Bei anderen Geweben oder proteomischer Proben zu verwenden, sollten die Probenvorbereitungsverfahren angepasst werden.)
- Gewebehomogenisierung:
ein. Waschhirngewebe (50 bis 100 mg) mit 1x Phosphatpufferlösung dreimal für fünf Minuten.
b. Homogenisieren des Gewebes in einer 1: 1: 2,5 Gewebe- / metallischen Perlen / SDC Homogenisierungspuffer (Tabelle 2) Verhältnis (w / w / v) für 5 min bei 4 ° C in Safe-Lock - Röhrchen bei maximaler Intensität ein Gewebe - Homogenisator. (Anmerkung: SDC Homogenisierungspuffer Proteaseinhibitoren umfassen kann , wie zuvor in 3 angegeben)
c. Zentrifugiere die Gewebehomogenat, erhalten from den vorherigen Schritt, bei 10.000 × g, 4 ° C für 10 min und den Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen sammeln.
d. Wiederholen Sie die Schritte bc für die verbleibenden Pellets und die Überstände so oft wie nötig kombinieren , bis kein Pellet beobachtet wird. (Hinweis: Wenn Sie die Schritte bc mehr als zwei Mal wiederholen müssen, bewegen Sie die Probe und die Perlen zu einem neuen Safe-Lock - Rohr den Verlust der Probe während des Zentrifugationsschritt zu verhindern).
e. Quantifizierung der Proteinkonzentration der erhaltenen Homogenate von Bicinchoninsäure (BCA) 12. - Natriumdeoxycholat (SDC) -Assistierte in-Lösung Trypsinverdauung 13 Gehirnhomogenaten.
ein. Fügen eine Endkonzentration von 10 mM Dithiothreitol (DTT) (unter Verwendung der Stammlösung in Lösung 5 von Tabelle 3 angegeben) auf das erhaltene Homogenisat die Reduktion von Protein - Disulfid - Bindungen zu initiieren.
b. Inkubieren des Homogenisats während 30 Minuten in einem Badbei 60 ° C voreingestellt.
c. In das Homogenat zu einer Endkonzentration von 20 mM Iodacetamid (IAA) unter Verwendung der Stammlösung in Lösung 7 von Tabelle 4 angegeben.
d. Inkubieren des Homogenats IAA bei Raumtemperatur im Dunkeln während 45 min enthält.
e. Verdünne das Hirnhomogenat zwei Faltungen unter Verwendung Verdünnungspuffer (Lösung 6 von Tabelle 3).
f. Inkubieren der Probe für eine zweite Reduktionsstufe während 30 Minuten bei 37 ° C.
G. Hinzufügen Sequenzierungs-grade-modifiziertes Trypsin , gelöst in Lösung 2 von Tabelle 2 bei Protein-zu-Enzyme Verhältnis 1:50 (w / w).
h. Digest des Homogenats mit Trypsin durch Inkubation über Nacht bei 30 ° C.
ich. Quenche die enzymatische Verdauung am nächsten Tag um 0,5% Endkonzentration Ameisensäure (FA) Zugabe. (Hinweis: Die Zugabe von FA Fällung der SDC Salz unter sauren Bedingungen führen.)
j. Sanft vortexen die Proben SDC precipi enthälttates.
k. Pellet die SDC Salze nach unten, indem die Proben bei 12.000 × g, 4 ° C während 10 min zentrifugiert.
l. Die überstehende Flüssigkeit und dann die Flüssigkeit in ein sauberes neues Röhrchen. (Anmerkung: während der Pipettieren dieses Schrittes Achten Sie darauf, nicht erneut zu suspendieren und / oder sammeln Salze aus dem SDC-Pellet.)
Meter Das SDC - Pellet in SDC Wiederauflösepuffer (Tabelle 5) unter kräftigem Vortexen für 1 min wieder aufzulösen.
n. Wiederholen Sie die Schritte Jl zweimal , um ausgefallenes Peptide zu erholen und die Überstände kombinieren. (Anmerkung:. Siehe Serra et al 2016 13 für weitere Einzelheiten über die SDC-assistierte in-Lösung Trypsinverdauung Protokoll hier angepasst.) - Die Entsalzung von tryptischen verdauten Proben.
ein. Perform Entsalzen der verdauten Proben, die eine 1 g C-18-Patrone. (Anmerkung: Die Verwendung einer großen Volumen Patrone (5 ml), unabhängig von der Menge an Protein, erhielt garantiert korrekte Reinigung der verbleibenden SDC Salze in den Proben vorLC-MS / MS-Injektion.)
b. Führen Konditionierung der 1g C-18 Kartusche mit 5 ml Acetonitril (ACN).
c. Übergeben von 5 ml clean-up - Puffer (Tabelle 6) durch die konditionierte 1 g C-18 Kartusche verbliebener organische Lösungsmittel zu entfernen.
d. Legen Sie die Probe auf die 1 g C-18-Patrone.
e. Führen von 3 bis 5 Reinigungsschritten auf die Probe in der 1 g C-18 - Säule unter Verwendung von 5 ml clean-up - Puffer jeden Schritt.
f. Eluieren der entsalzten Peptide aus dem 1 g C-18 Kartusche unter Verwendung von 5 ml Elutionspuffer (Tabelle 7).
G. Trocknen Sie die eluierten Peptide in einem Vakuum-Konzentrator.
c. Rekonstituieren die getrocknete Probe in einem Endvolumen von 200 & mgr; l Elutionspuffer. . (Anmerkung: Verwenden kräftig und lange (> 10 min) gefolgt von Vortexen anschließende Beschallung in einem Ultraschallbad während 30 min vollständig resuspendieren die getrockneten Peptide in Injektionspuffer)
d. Stellen Sie das Injektionsvolumen der Probe für LERLIC-MS / MS zu analysieren zwischen 1 bis 3 & mgr; g Protein.
3. One-Dimension LERLIC-MS / MS-Trennung
- Flüssigchromatographie Bedingungen:
Mobile Phasen:
A: 0,1% FA in Wasser (Tabelle 8).
B: 0,1% FA in ACN (Tabelle 9)
Fließgeschwindigkeit: 0,4 ml / min
Säule: LAX Kapillarsäule (50 cm Länge - 200 um ID)
ein. Verwenden Sie das folgende 1200 min-Gradient: 95% B für 40 min, 95-85% B während 434 min, 85-70% B während 522 min, 70-35% B während 124 min, 35-3% B für 45 min , isokratisch bei 3% B für 5 Minuten, 3-95% B über 7 min gehalten und bei 95% B für 23 min isokratisch.
b. Führen Trennung der Peptide , die die Kapillar - LAX , wie in Serra & Gallart-Palau et al angegeben. 3 unter Verwendung von Ultrahochdruck - Flüssigkeitschromatographie. - Massenspektrometer-Konfiguration:
ein. Konfigurieren Sie die Scan-Ereignisdetails Datenerfassung Wechsel betwe ausführenen vollständige Fourier-Transformations-Massenspektrometrie (FT-MS) und Fourier-Transformations-Tandem-Massenspektrometrie (FT-MS / MS) mit den folgenden Parametern:
a.1. Datenerfassungsmodus: positiv
a.2 FT-MS Parameter:
Massenbereich: 350 - 2000 m / z
Auflösung: 60.000
Microscans: 1 pro Spektrum
Automatische Verstärkungsregelung: 1 × 10 6
a.3 FT-MS / MS-Parameter:
Fragmentierungsmodus: Hochenergie-Kollisions-Dissoziation (HCD)
A.4 Massenbereich: 150 - 2000 m / z
A.5 Auflösung: 30.000
A.6 Top N-Ionen: 10
Microscans: 1 pro Spektrum
Ladezustand:> 2+
Isolationsbreite: 2 Da
A.7 Automatische Verstärkungsregelung: 1 × 10 6
b. Führt Massenspektrometrie Nachweis von Peptiden , wie in 3 unter Verwendung eines Orbitrap - Massenspektrometer mit einer Nanoelektrospray - Ionenquelle ausgerüstet angegeben bei 1,5 kV arbeitet.
4. Datenanalyse
- Führen Sie protein Datenbanksuche auf den LERLIC-MS / MS erhaltenen Daten der folgenden Parameter unter Verwendung einer spezifische Proteom - Software: (Hinweis: Siehe 3 für weitere Details.)
ein. Ionen-Toleranz: 10 ppm
b. Fragmention Toleranz: 0,05 Da
c. False Discovery Rate (FDR): 1%
d. Datenbank: UniProt Menschliche Datenbank
e. Feste Modifikationen: Carbamydomethylation bei Cys
f. Variable Modifikationen (wenn von der Software erforderlich): Oxidation (Met), Deamidierung (Asn und Gln). - Überzeugte Charakterisierung und Quantifizierung von isomeren deamidiertes Produkten in LERLIC-MS / MS-Daten:
ein. Export-Datenbank Sucher von LERLIC-MS / MS zu einer spreedsheet Software für die Analyse.
b. Suchen und extrahieren Sie die ganze Liste von deamidiertem Peptide und deren nichtdeamidierter Pendants.
c. Unter Verwendung die Liste des erhaltenen Peptide als Referenz, extrahiert die Ionenchromatogramme (XICS) diese Peptide, die eine sachgemäße Software bei 5 ppm Massentoleranz verwendet wird. (Hinweis:Siehe 3 für weitere Details über die Software für die Extraktion von XICS verwendet.)
d. Eine Sichtkontrolle des erhaltenen XICS der separierten Doppelpeak Elution der isomeren Produkte zu identifizieren , wie 3 angegeben. (Anmerkung: isomere Produkte dieser Peptide bei MS / MS-Ebene identifiziert wird, kann leicht durch das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Retentionszeiten in dem Datenbank Suchergebnis geführt zu finden.)
e. Relative Quantifizierung der isomeren Produkte aus jeder deamidierten site / Peptid auf der Basis der Peakfläche von jedem identifizierten Isomer in den erhaltenen XICS durchgeführt werden.
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Representative Results
Deamidierung von Gln und Asn - Resten ist eine degenerative Proteinmodifikation (DPM) 14 in mehreren chronischen und tödlichen Krankheiten verwickelt angesehen. Es hat sich gezeigt , dass diese PTM die 1 - Halbwertszeit und Abbau Staaten von Antikörpern und anderen Molekülen im menschlichen Körper und ähnliche biologische Hintergründe vorhersagen können, 15. Die Bedeutung von Protein Desamidierung in der Tat geht über den biomedizinischen Kontext, daher ist diese Modifikation vorliegt in diversen Proteome 16, 17 und einige Studien haben das Potenzial der Desamidierung zu dem Zeitpunkt gezeigt , eine genaue Datierung der Bilder durchzuführen und archäologische Überreste 18, 19 . Obwohl Bedeutung und Funktionalität von Protein Desamidierung in den unterschiedlichsten Hintergründen wurden für lange Zeit bestätigt, diere war bis vor kurzem ein Mangel an technischen Fortschritt auf dem Weg , eine eingehende Charakterisierung dieses PTM 3 zu erreichen.
Anwendung von LERLIC-MS / MS - 3, wie in 1 dargestellt ist , sieht die erste Zeit und in einer einzigen Durchlauf gelöst Trennung von Gln und Asn desamidiert Isoformen von komplexen Proteomen oder Modellverbindungen auch für solche Peptide , die zwei unabhängige Asn und Gln desamidiert proteoforms.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der LERLIC-MS / MS - Arbeitsablauf für die Trennung und Quantifizierung von Gln und Asp Desamidierungsprodukten von Complex Samples durch Shotgun Proteomics. LERLIC-MS / MS umfasst Proteinextraktion und enzymatischen Abbau vor der eindimensionalen Trennung von Peptiden, die durch LC-MS / MS die LAX Kapillarsäule. AnaLyse von XICS erlauben die Identifizierung von Desamidierung isomeren Produkte zu verschiedenen Retentionszeiten , basierend auf ihren unterschiedlichen Säure eluiert 3, 20, 21. MS / MS ermöglicht die Unterscheidung zwischen desamidierten und nicht-desamidierten Peptide und zuversichtlich Identifizierung des desamidierten Rückstandes. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Enzymatisch modifizierte Zwischen Gln Reste von Umamidierung ein invertiertes γ / α-Glutamyl - Verhältnis (Abbildung 2) die Anzeige kann durch LERLIC-MS / MS freigelegt und charakterisiert werden, die auf die Untersuchung von proteinopathy bei neurodegenerativen Erkrankungen erhebliche Auswirkungen haben könnte , 3, 22, 23 . 24. Ferner kann , wie zuvor in Serra & Gallart-Palau 2016 mehrere unbekannte PIMT Substratproteine präsentiert ein invertiertes Isoasp / asp - Verhältnis in deamidierten Asn - Reste können auch berichtet , in menschlichen Geweben durch LERLIC-MS / MS 3 identifiziert werden.
Figur 2: Inspektion von XICS und Identifizierung von Doppelretentionszeiten an der MS / MS - Ebene für die desamidierte Peptide erlaubt Charakterisierung von Gln und Asn desamidierte Isomere und Identifikation von Produkten von Crucial enzymatischen Reaktionen, die in Desamidierung nehmen. ein. Detail der XIC der beiden Peaks entsprechend den γ / α-Glutamyl-Isomeren des Peptids FQMPDQGMTSADDFFEQ # GTK aus dem Gehirn Protein DPYL2 zeigt Dihydropyrimidinase related-Protein 2. Das invertierte γ / α-Glutamyl-Verhältnis detected in diesem Peptid zeigt das Potential Implikation der γ-Glutamyl-enthaltenden Spezies in der Reaktion als Transglutaminierung Transglutaminase γ-Glutamyl-Zwischenprodukt. Der Rückstand wurde durch deamidierten MS / MS an beiden Retentionszeiten, b verifiziert. bei 389,1 min entsprechend der α-Glutamyl-enthaltenden Peptid und c. bei 401.4 min, entsprechend der γ-Glutamyl-enthaltende Peptid. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Als Neuheit dieses Papier, fanden wir , dass LERLIC-MS / MS - Charakterisierung des Succinimid - Zwischenprodukt (3) ermöglicht. Die Verwendung von milden sauren pH - Wert während der Probenverarbeitung stabilisiert das Succinimid in Zwischen modifizierten Asn - Resten 25. Daher ermöglicht LERLIC-MS / MS-Proteom-weite Studie des succinimide Intermediat, eine labile und schlecht verstanden Modifikation mit signifikanten physiologischen und pathologischen Auswirkungen 26.
Abbildung 3: Identifizierung des Succinimids Intermediate in Asn - Rest durch LERLIC-MS / MS. ein. Spektrum des Asn desamidiert Peptid YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR aus dem Gehirn Protein ALDO C Aldolase C. desamidierte Rest als Deam-Asn angedeutet ist. b. Spektrum des Peptids YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, die in diesem Fall zeigt eine Massenverschiebung von -17 Da bei der zuvor desamidiert Asn-Rest (Scc-Asn) aufgrund des Ammoniumverlust, die stattfinden während der Bildung des Succinimids Zwischenprodukt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen thFigur.
| Komponente | Menge für 100 ml |
| Isopropanol | 90 ml |
| Wasser | 10 ml |
Tabelle 1. Verpackung Pufferzusammensetzung (90% Isopropanol).
| Lösung 1: 1 M Ammoniumacetat. | |
| Komponente | Menge für 50 ml |
| Ammoniumacetat | 3,86 g |
| Wasser (zugegeben bis zu 50 ml) | ~ 50 ml |
| Lösung 2: 100 mM Ammoniumacetat. | |
| Komponente | Menge für 50 ml |
| Lösung 1 | 5 ml |
| Wasser | 45 ml |
| Lösung 3: 10% Natriumdeoxycholat. | |
| Komponente | Menge für 1 ml |
| Natriumdesoxycholat | 0,1 g |
| Wasser | 1 ml |
| Lösung 4: SDC Homogenisierungspuffer (100 mM Ammoniumacetat, enthaltend 1% Natriumdesoxycholat). | |
| Komponente | Menge für 10 ml |
| Lösung 2 | 9 ml |
| Lösung 3 | 1 ml |
Tabelle 2. SDC Homogenisierungspuffer Zusammensetzung (100 mM Ammoniumacetat , enthaltend 1% Natriumdesoxycholat). Bereiten Sie die Lager solution von 1 M Ammoniumacetat (Lösung 1) und verdünnten 100 mM Ammoniumacetat (Lösung 2) zu erhalten. Zusätzlich bereitet die Stammlösung von 10% Natriumdeoxycholat (Lösung 3). Bereiten Sie die SDC Homogenisierungspuffer wie in Lösung 4 beschrieben.
| Lösung 5: 1 M DTT | |
| Komponente | Menge für 10 ml |
| Dithiothreitol | 77 mg |
| Lösung 2 (siehe Tabelle 2) | 0,5 ml |
| Lösung 6: Verdünnungspuffer | |
| Komponente | Menge für 10 ml |
| Lösung 5 | 0,1 ml |
| Lösung 2 (siehe Tabelle 2) | 9,9 ml |
Tabelle 3 Verdünnungspuffer Zusammensetzung (100 mM Ammoniumacetat , enthaltend 10 mM Dithiothreitol (DTT)). Bereiten Sie die Stammlösung von 1 M DTT (Lösung 5) und anschließend das Verdünnungspuffer herzustellen, wie 6 in Lösung beschrieben.
| Lösung 7: 1 M IAA | |
| Komponente | Menge für 10 ml |
| IAA | 93 mg |
| Lösung 2 (siehe Tabelle 2) | 0,5 ml |
Tabelle 4. Alkylierungen Pufferzusammensetzung (100 mM Ammoniumacetat , enthaltend 20 mM Iodacetamid (IAA)). Bereiten Sie die Stammlösung von 1 M IAA (Lösung 7).
| Komponente | Menge für 50 ml |
| Ammoniumhydroxid | 0,25 ml |
| Wasser | 24.75 ml |
Tabelle 5. SDC erneutes Lösen Pufferzusammensetzung (0,5% Ammoniumhydroxid).
| Komponente | Menge für 100 ml |
| Trifluoressigsäure | 0,1 ml |
| Wasser | 99,9 ml |
Tabelle 6. Aufräumpuffer (0,1% Trifluoressigsäure).
| Komponente | Menge für 100 ml |
| Acetonitril | 75 ml |
| Ameisensäure | 0,1 ml |
Tabelle 7. Elutionspuffer (75% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure).
| Komponente | Betrag für 1000 ml |
| Ameisensäure | 1 ml |
| Wasser | 999 ml |
Tabelle 8. Mobile Phase A Zusammensetzung.
| Komponente | Betrag für 1000 ml |
| Ameisensäure | <td> 1 ml|
| Acetonitril | 999 ml |
Tabelle 9. Mobile Phase B Zusammensetzung.
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Discussion
In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein Schritt- für -Schritt - Protokoll von LERLIC-MS / MS 3 wird ein Verfahren in dem Tiefen gehende Charakterisierung durchzuführen , und um genau das Ausmaß des Protein Desamidierung und die enzymatischen Prozesse auf dieser Proteinmodifikation beteiligt zu bestimmen. LERLIC-MS / MS basiert auf der Verwendung einer langen Länge (50 cm) LAX nach dem Prinzip der elektrostatischen Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung - Chromatographie (Erlić) 27. Die Verwendung einer Säule mit langer Länge, wie 3 in unserer Studie gezeigt, maximiert das Potential von Erlić getrennte Peptide gemäß ihrem isoelektrischen Punkt 27.
LERLIC-MS / MS stellt eine neuartige shotgun eindimensionale Trennstrategie, einen Arbeitsablauf, die Zeit-on-Hände während der Probenverarbeitung speichert , obwohl es eine 1.200 min - Gradienten erfordert , wie in 3 angegeben ist auf sehr komplexe Proteome optimale Ergebnisse zu erhalten. A 60 min gradient in LERLIC-MS / MS kann auch eine optimale Trennung von Gln Desamidierung Isoformen an Modellverbindungen zum ersten Mal in Shotgun Proteomics 3 erreichen. Basierend auf diesen beiden Anwendungen, wir spekulieren , dass eine Trennung zweite Dimension von LAX Kapillare durchgeführt kann bisher von unserer Gruppe 10 verwendete für die Analyse von Proben der mittleren Komplexität, ein Workflow unter einem mehrdimensionalen Chromatographie Ansatz zu einem ersten Dimension Umkehrphasenchromatographie gekoppelt werden.
Probenvorbereitung für die Analyse von Protein Deamidierung ist ein entscheidender Schritt, die besondere Aufmerksamkeit erfordert 1 das Auftreten von artifizieller Desamidierung auf Asn - Resten an einem großen Ausmaß zu verhindern. Hao et al. festgestellt , dass tryptischen Verdau unter milden sauren pH - Wert verhindert signifikant Erscheinung artefactual Desamidierung bei der Probenvorbereitung 28 auf . Wir haben in dieser Studie unserer SDC-assisted in Lösung Versuch verwendetptic Verdauung 13, eine Methode , bei der Probenverarbeitung 6. Auf der anderen Seite bei einem pH durchgeführt, stärker sauren Bedingungen könnte die Fähigkeit von Trypsin - Verdau herausfordern , wenn der pH niedriger als 6 29 gehalten wird. Auseinandersetzung mit diesem Thema, vor kurzem Liu et al. haben eine optimale Verdauung Strategie berichtet , die durch Substituieren von Trypsin durch Glu-C bei pH 4,5 30 an Asn - Reste erfolgreiche Verdauung und Verhinderung des Auftretens von artefactual Desamidierung ermöglicht. Die Umsetzung der von Liu et al Verdauungsmethode. 30 Asn Desamidierung von LERLIC-MS / MS könnte eine mögliche Strategie sein , die erfordert experimentelle Verifikation zu analysieren.
Das Protokoll in diesem Video-Artikel beschrieben hat ein großes Potenzial weiter zu charakterisieren und zur Zeit unbekannt Isoform Verhältnis Arrays quantitativ zu bestimmen, die die Beteiligung von Protein Desamidierung in Alterung und Krankheiten des Menschen zu definieren. Pelzterhin, Anwendung von LERLIC-MS / MS in anderen biologischen Hintergründen wird helfen, die Möglichkeiten und Risiken von Protein Desamidierung als molekulare Uhr Modifikation zu bestimmen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem Singapore Ministry of Education (Tier 2: Grant ARC9 / 15) unterstützt wird, National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0.003-2.016) und NTU-NHG Alternsforschung Grant ( Grant-ARG / 14017). Wir möchten unsere Dankbarkeit und aufrichtigsten Dank an Dr. Andrew Alpert und PolyLC Team zum Ausdruck bringen für haben uns freundlicherweise mit den Verpackungsmaterialien, die möglich diese Studie gemacht.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
