Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fracionamento de Membranas Cerebrais: Um Published: May 12, 2017 doi: 10.3791/55661
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 3, 1,2
1Unitat de Farmacologia, Departament Patologia i Terapèutica Experimental, Facultat de Medicina, IDIBELL, Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat, 2Institut de Neurociències, Universitat de Barcelona, 3Center for Neurosciences of Coimbra, Institute of Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Coimbra
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo de fracionamento de membrana cerebral que representa um procedimento robusto para isolar proteínas pertencentes a diferentes compartimentos sinápticos.

Abstract

Avaliar a composição ea função das proteínas sinápticas constitui um desafio importante na neurociência. No entanto, não é fácil avaliar a neurotransmissão que ocorre dentro das sinapses, pois é altamente regulada por interações dinâmicas proteína-proteína e eventos de fosforilação. Consequentemente, quando qualquer método é utilizado para estudar a transmissão sináptica, um objectivo principal é preservar estas modificações fisiológicas transitórias. Aqui, apresentamos um protocolo de fracionamento de membrana cerebral que representa um procedimento robusto para isolar proteínas pertencentes a diferentes compartimentos sinápticos. Em outras palavras, o protocolo descreve uma metodologia bioquímica para realizar o enriquecimento protéico a partir de compartimentos pré-sinápticos, pós-sinápticos e extrasinápticos. Primeiro, os sinaptossomas, ou terminais sinápticos, são obtidos a partir de neurônios que contêm todos os compartimentos sinápticos por meio de um gradiente descontínuo de sacarose. De notar, a qualidade desta preparação de membrana sináptica inicial é cRitical. Subsequentemente, o isolamento dos diferentes compartimentos subsinápticos é conseguido com solubilização leve utilizando detergentes suaves a condições de pH diferenciais. Isto permite a separação por gradiente e centrifugações isopicnicas. Por fim, o enriquecimento protéico nos diferentes compartimentos sub-sinápticos ( ie, frações de membrana pré, pós e extrasináptica) é validado por meio de análise de imunotransferência utilizando marcadores de proteína sináptica bem caracterizados (SNAP-25, PSD-95 e sinaptofisina, Respectivamente), permitindo assim uma avaliação directa da distribuição sináptica de qualquer proteína neuronal particular.

Introduction

A transmissão sináptica baseia-se na integridade física da sinapse, um conceito que estava previsto já em 1897 por Foster e Sherrington 1 . Assim, a compreensão da distribuição de componentes chave de neurotransmissão ( por exemplo, canais iónicos, receptores, etc. ) é essencial para elucidar a função sináptica, tanto em condições normais como patológicas. A microscopia eletrônica (EM) tem contribuído enormemente para a atual noção ultraestrutural das sinapses prototípicas do sistema nervoso central (SNC). Desta forma, EM tem finamente estabelecido as diferenças entre as densidades pré e pós-sinápticas, que são separadas por uma fenda de uma distância bastante uniforme (~ 25 nm) 2 . Curiosamente, o aparelho pós-sináptico exibe um espessamento relativamente contínuo, denso de elétrons abaixo de sua membrana plasmática, a chamada densidade pós-sináptica, ou PSD2. Inversamente, no aparelho pré-sináptico,E a rede de citomatriz descontínua é disposta logo abaixo da membrana plasmática, que é essencial para o alinhamento e acoplamento das vesículas sinápticas à zona activa da membrana plasmática 3 . Assim, EM constitui a aproximação experimental dourada para pesquisar a distribuição de proteínas dentro das sinapses do SNC estruturalmente preservadas. No entanto, as informações fornecidas por micrografia eletrônica é estática. De fato, as evidências acumuladas mostram que as sinapses in vivo são extremamente dinâmicas, experimentando, assim, mudanças estruturais dramáticas na transmissão sináptica sustentada. Além disso, a morfologia e composição das sinapses podem mudar ao longo de diferentes regiões do SNC e ao desenvolvimento, maturação, envelhecimento e desenvolvimento de condições neuropatológicas. Globalmente, um protocolo focado no isolamento de proteínas pertencentes a diferentes compartimentos sinápticos em condições fisiológicas representa uma ferramenta valiosa para um estudo mais abrangente do funcionamento sináptico.

et al . (2001) 4 , é baseado em um deslocamento do pH que enfraquece as interações adesivas ocorrendo dentro do aparelho pré e pós-sináptico. Em primeiro lugar, utilizando detergentes suaves a pH 6,0, é possível discernir a junção de aderentes que mantém o aparelho pré e pós-sináptico e que é mantida a partir do domínio da membrana extra-sináptica, que é solubilizada e, assim, pode ser extraída dos contatos sinápticos. Subsequentemente, aumentar o pH de 6,0 para 8,0 na presença de detergentes suaves enfraquece a resistência da junção de aderentes que mantém a zona activa pré-sináptica fortemente ligada à densidade pós-sináptica. Assim, o compartimento pré-sináptico éLubilizado e pode ser separado da densidade pós-sináptica, que é preservada principalmente porque a concentração de detergente usado não promove sua solubilização 4 . Curiosamente, a eficiência de fraccionamento, eventualmente superior a 90%, pode ser confirmada por diferentes marcadores sub-sinápticos: i ) proteína sinaptosomal associada 25 (SNAP-25), da zona pré-sináptica activa; Ii ) sinaptofisina, a partir da fracção extra-sináptica ( isto é, fora da zona activa e incluindo microssomas); E iii ) proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95), a partir da densidade pós-sináptica. Notavelmente, este método de fraccionamento de membrana cerebral tem sido utilizado com sucesso. Consequentemente, tem sido possível determinar com precisão a localização subsináptica de diferentes receptores, tais como receptores 5 de ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA), receptor A1 de adenosina (AiR) 6 ,Receptor A 2A (A 2A R) 7 de adenosina, receptores P2 de trifosfato de adenosina (ATP) 8 , subunidades nicotínicas do receptor de acetilcolina 9 e receptor GPR37 associado à doença de Parkinson 10 . No entanto, uma série de limitações podem impedir a avaliação adequada da distribuição sináptica de uma determinada proteína neuronal. Desta forma, neste procedimento, não apenas descrevemos totalmente o protocolo, como também destacamos alguns pontos críticos a serem considerados, como a grande quantidade de tecido necessário, o baixo rendimento protéico eo requisito obrigatório para validar a eficiência de Cada separação antes de realizar a experiência definida.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais (CEEA) da Universidade de Barcelona, ​​de acordo com as diretrizes descritas no Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório 11 e seguindo a Lei 86/609 / CCE, FELASA e ARRIVE. Assim, os ratinhos são alojados em gaiolas padrão, com acesso ad libitum a alimentos e água, e são mantidos sob condições padrão controladas (ciclo de luz / luz de 12 h a partir das 7:30 horas, temperatura de 22 ° C e 66% de humidade).

1. Obtenção de Sinaptossomas Cerebrais de Rato Utilizando um Gradiente de Sacarose Ininterrupto

Nota: Este método foi relatado anteriormente 10 .

  1. Preparar um novo tampão de isolamento (IB), pH 7,4; Sacarose 2 M; Sacarose 1 M / CaCl2 0,1 mM; E CaCl2 0,1 mM (ver Tabela 1 ). Chill as soluções em gelo.
  2. SaCrifice cinco camundongos por deslocamento cervical. Decapitar e remover rapidamente o cérebro de cada animal. Dissecar a região cerebral de interesse (ou seja, o hipocampo, 0,25-0,35 g de tecido fresco) e colocá-lo em um tubo de vidro Potter-Elvehjem 5 mL em gelo com 1 mL de IB.
  3. Homogeneizar o tecido utilizando um agitador de homogeneização (10 ciclos a 700-900 rotações por minuto), preferencialmente num banho de gelo para impedir o aquecimento da amostra.
  4. Colocar o tecido homogeneizado (1 mL) num tubo de 15 mL contendo 6 mL de sacarose 2 M e 2,5 mL de CaCl2 0,1 mM a 4 ° C. Misturar lentamente, invertendo o tubo.
    Nota: A adição de cálcio é essencial para manter as interacções adesivas entre as organelas e assim preservar a estrutura das diferentes "densidades".
  5. Colocar a solução num tubo de centrífuga de 12 mL e adicionar lentamente 2,5 mL de sacarose 1 M / CaCl2 0,1 mM em cima de cada tubo para formar o gradiente de sacarose.
    Nota: Rotule a posição oF da interface de gradiente no tubo de centrífuga utilizando um marcador permanente.
  6. Pesar e equilibrar os tubos de centrífuga com solução IB dentro dos suportes de aço correspondentes e com as tampas de fechamento.
  7. Centrifugar os tubos durante 3 h a 100 000 x g e 4 ° C usando uma centrífuga de rotor de balde giratório. Completamente preencher o rotor com todos os suportes de aço (mesmo vazio, se necessário).
  8. Descarte a camada superior contendo mielina. Com uma pipeta Pasteur, coletar o anel branco entre a interphase de sacarose 1,25-M e 1-M correspondente à fração de sinaptossoma.
  9. Diluir os sinaptossomas com 9X seu volume usando IB em um tubo de centrífuga.
  10. Pesar e equilibrar os tubos de centrífuga com solução IB dentro dos suportes de aço correspondentes e com as tampas de fechamento.
  11. Centrifugar os tubos durante 30 min a 15.000 x g e 4 ° C usando uma centrífuga de rotor balde balançando.
  12. Descartar o sobrenadante eE pellet com 1,1 mL de solução IB. Recolher 100 μL desta solução sinaptosomal e centrifugar durante 5 min a 11.000 x g e 4 ºC.
  13. Ressuspender o sedimento sinaptosomal em 5% de dodecilsulfato de sódio (SDS) e armazenar esta amostra a -20 ºC.
    Nota: Esta amostra corresponderá à fracção de sinaptossoma total para análise Western-blot adicional. A fração sinaptosomática restante (~ 1 mL) pode ser congelada a -20 ºC até ser utilizada ou processada para posterior fracionamento sub-sináptico. Os sinaptossomas ou sinapses purificadas representam entre 1 e 2% do volume total do hipocampo 12 .

2. Isolamento pré, pós e extra-sináptico

  1. Preparar 2x tampão de solubilização fresco, pH 6,0; 1x tampão de solubilização, pH 6,0; Tampão de solubilização, pH 8,0; E CaCl2 0,1 mM (ver Tabela 1 ). Chill as soluções em gelo.
    Nota: O pH destas soluções deve ser accuratelY ajustado para se obter um bom fraccionamento subsináptico.
  2. Diluir lentamente a fracção sinaptossómica ressuspendida de 1 mL (ver passo 1.12) com 5 mL de CaCl2 0,1 mM.
  3. Adicionar o mesmo volume (5 mL) de tampão de solubilização 2x gelado, pH 6,0, e incubar durante 50 min em gelo sob agitação elevada num copo em gelo.
    Nota: Enquanto 1% de Triton X-100 a pH 6,0 solubiliza todas as proteínas da membrana plasmática, preserva proteínas dentro dos contatos sinápticos ou junções ( isto é, estruturas pré e pós-sinápticas) 4 .
  4. Coloque a solução num tubo de centrífuga. Pesar e equilibrar os tubos com volumes equivalentes de CaCl2 0,1 mM e solução de tampão de solubilização 2x, pH 6,0, dentro dos seus suportes de aço correspondentes e com as suas tampas de fecho.
  5. Centrifugar os tubos durante 30 min a 40.000 x g e 4 ° C usando uma centrífuga de rotor balde balançando. O sobrenadante resultante representa a fracção extra-sináptica,E o grânulo corresponde às junções sinápticas ( ie, frações pré e pós-sinápticas).
  6. Concentrar o sobrenadante contendo a fracção extra-sináptica para um volume final de 200 μL utilizando um tubo de filtro de 15 ml 10 K centrifugado a 4 000 xg e 4 ºC.
  7. Precipitar a fracção extra-sináptica concentrada resultante (200 μL) com 5 volumes (1 mL) de acetona pré-arrefecida (-20 ° C) durante a noite a -20 ° C.
  8. No dia seguinte, centrifugar a fracção extra-sináptica durante 30 min a 18.000 x g e -15 ° C. Após centrifugação, descartar o sobrenadante de acetona e secar o sedimento para remover qualquer vestígio de acetona.
  9. Finalmente, ressuspender o sedimento contendo as proteínas extrasinápticas com 200 μL de SDS a 5%. Sonicate o pellet, se necessário.
  10. Sem interrupção, lavar cuidadosamente a pastilha contendo as fracções pré e pós-sinápticas com 2 mL de tampão de solubilização 1x, pH 6,0. Descarte o buffer.
  11. RessuspenderO sedimento com 10 mL de tampão de solubilização 1x, pH 8,0, utilizando uma pipeta Pasteur de vidro.
    Nota: Enquanto 1% de Triton X-100 a pH 8,0 solubiliza a especialização pré-sináptica, preserva a densidade pós-sináptica insolúvel 4 .
  12. Incubar a suspensão durante 50 min em gelo sob agitação elevada num copo em gelo.
  13. Coloque a solução num tubo de centrífuga. Pesar e equilibrar os tubos com uma solução tampão de solubilização 1x, pH 8,0, dentro dos seus suportes de aço correspondentes e com as suas tampas de fecho.
  14. Centrifugar os tubos durante 30 min a 40.000 x g e 4 ° C usando uma centrífuga de rotor de balde giratório; O sobrenadante resultante corresponde à fracção pré-sináptica e ao grânulo à fracção pós-sináptica.
  15. Processar o sobrenadante contendo a fracção pré-sináptica, como descrito nos passos 2.6-2.9.
  16. Ressuspender o sedimento contendo a fracção pós-sináptica com 200 μL de SDS a 5%. Sonicate o pellet, iF necessário.

3. Analisar as amostras por imunotransferência para validar o fraccionamento da membrana

  1. Determine a quantidade de proteína em cada fração ( isto é, as frações total, extra, pré e pós-sinápticas) usando o ensaio de proteína de ácido bicinconínico.
  2. Tomar 20 μg de proteína de cada fracção e diluí-la até um volume final de 50 μL em tampão de amostra de electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Ferva durante 5 min a 100 ºC.
  3. Separar as proteínas por electroforese SDS-PAGE a 10%, com um gel concentrador a 4% sob condições redutoras. Eletroforese a uma tensão constante de 80 V até o corante entrar no gel inferior e então aumentar a tensão para 120 V.
  4. Transferir as proteínas para uma membrana de PVDF e bloquear com solução de bloqueio IB durante 45 min à temperatura ambiente sob agitação contínua.
  5. Incubar a membrana durante a noite a 4 ºC com o anticorpo primário indicado ( isto é, anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-sinaptofisina ou anti-GPR37) diluída em solução de bloqueio IB sob agitação contínua.
  6. Lavar a membrana três vezes (10 min cada) com solução de lavagem IB para eliminar o anticorpo primário não ligado.
  7. Incubar com o anticorpo secundário indicado durante 90 min em condições escuras à temperatura ambiente sob agitação contínua.
  8. Lavar a membrana três vezes (10 min cada) com solução de lavagem IB para eliminar o anticorpo secundário não ligado.
  9. Incubar a membrana com substrato quimioluminescente (preparar a mistura em condições escuras e seguir a proporção 1: 1 das soluções A e B fornecidas pelo fabricante).
  10. Analisar a membrana em um dispositivo de detecção quimioluminescente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A metodologia descrita tem sido amplamente utilizada para a análise subsináptica de proteínas neuronais em geral e para o isolamento e caracterização bioquímica de receptores sinápticos 5 , 6 , 7 , 8 , 9 em particular. Curiosamente, o resultado representativo apresentado aqui mostra a utilidade deste procedimento experimental para a análise da distribuição do hipocampo sub-sináptico de um receptor órfão acoplado à proteína G, nomeadamente, o receptor associado à doença de Parkinson GPR37 10 . GPR37 foi originalmente identificado através de pesquisas de homólogos para endotelina e receptores 13 de bombesina, embora se tenha verificado não se ligar a endothelinas ou péptidos relacionados. Em seu lugar, GPR37 foi proposto para ser ativado pelo ativador de cabeça pEp�de 14 , 15 , 16 e, mais recentemente, pelos neuropept�eos prosaposina e prosap�de 17 , embora estas associa�es sejam ainda universalmente aceites. O GPR37 recebeu a maior atenção pela sua ligação com a doença de Parkinson 18 . Assim, existe um interesse significativo em conhecer a neurobiologia deste intrigante receptor, tanto em condições normais como patológicas. Portanto, a descoberta da localização de GPR37 subsináptica pode ajudar a esclarecer sua função dentro do cérebro. Para este fim, o hipocampo foi primeiro isolado de ratinhos C57BL / 6J (WT) e GPR37-KO às oito semanas de idade. Em seguida, as fracções extra, pré e pós-subsinápticas foram purificadas utilizando o protocolo de fraccionamento de membrana (ver Figura 1 para uma visão esquemática do procedimento). Subseqüentemente, as purezas desses compartimentos subsinápticos foram verificadasSegregação dos respectivos marcadores sinápticos: i ) o marcador vesicular extra-sináptico (sinaptofisina); Ii ) o marcador de zona activa pré-sináptica (SNAP-25); E iii ) o marcador de densidade pós-sináptica (PSD95). Em conformidade, os enriquecimentos em sinaptofisina, SNAP-25 e PSD95 nas fracções extra, pré e pós-subsinápticas, respectivamente, foram analisados ​​por imunotransferência utilizando anticorpos específicos contra estas proteínas ( Figura 2 ). Assim, foi encontrada uma eficiência de fraccionamento de pelo menos 90% para cada marcador sináptico testado ( Figura 3 ), semelhante à descrita anteriormente 6 . Curiosamente, a imunorreatividade com GPR37 foi mais abundante (n = 3, P <0,001) na fração extra-sináptica quando comparada às frações pré-sináptica (20 ± 4%) e pós-sináptica (36 ± 2%) ( Figura 3 ). Além disso, os nossos dados indicaram que, embora presente na zona activa pré-sináptica, o GPR37 era principalmenteNa densidade pós-sináptica (n = 3, P <0,05) ( Figura 3 ). Em geral, o protocolo de fraccionamento da membrana cerebral permitiu a avaliação da distribuição subsináptica de GPR37 no hipocampo do rato, proporcionando assim informação valiosa para manipulações futuras deste receptor órfão.

figura 1
Figura 1: Representação esquemática de fluxograma do protocolo de fraccionamento de membrana. Todos os procedimentos experimentais são descritos na coluna da esquerda, enquanto que a recolha da amostra está representada na coluna da direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura2: Distribuição subsináptica de GPR37 no hipocampo do rato. Imunoblot representativo mostrando Sinaptofisina, SNAP-25 e PSD-95 como marcadores sinápticos específicos extra-, pré e pós-sinápticos, bem como imunorreatividade GPR37 em frações sinápticas do hipocampo de ratos WT e GPR37-KO. Os sinaptossomas do hipocampo (Syn) foram fraccionados em frações extra-sinápticas (Extra) e pré-sinápticas (Pre) e densidade pós-sináptica (Post). Estes foram analisados ​​por immunoblot (20 μg de proteína / via) utilizando a anti-sinaptofisina de coelho (1: 3000), anti-SNAP-25 de ratinho (1: 3000), anti-PSD95 de coelho (1: 3000) -GPR37 (1 � / mL). O anticorpo ligado primário foi detectado utilizando um anticorpo anti-coelho (1 / 30.000) de cabra conjugado com HRP ou um anticorpo anti-rato de coelho (1: 30.000). Estes dados são extraídos da referência 10 , com permissão. Por favor, clique em hPara ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Quantificação relativa do enriquecimento de GPR37 em frações extra-pré, e pós-sinápticas do hipocampo. As intensidades das bandas imunorreactivas nas membranas imunotransferidas correspondentes às fracções extra-sinápticas (coluna amarela extra), pré-sináptica (coluna pré, coluna verde) e pós-sináptica (coluna Post, coluna vermelha), mostradas na figura 2, foram medidas por varrimento densitométrico. As densidades foram quantificadas a partir de bandas não saturadas. Os valores foram normalizados (em% da varredura densitométrica relativa, RDS) utilizando a quantidade de Sinaptofisina, SNAP-25, PSD95 e GPR37 na fração mais enriquecida e foram apresentados como as médias ± SEM de três experimentos independentes 10 . Os asteriscos denotam dados significativamente diferentes: * p <0,05, *** p <0.001 (ANOVA de 1 via com um teste post hoc de Bonferroni). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Economia e Competitividade / Instituto de Saúde Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 e PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia 2010) ), E FC pertencem ao grupo de pesquisa acreditado "Neuropharmacology and Pain" (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . O trabalho também foi apoiado pelo "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras" da CAPES (Brasil) para FC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Pancreac Química SL, Barcelona, Spain 1,316,211,211
CaCl2 Pancreac Química SL, Barcelona, Spain 2,112,211,210
MgCl2·6H2O Pancreac Química SL, Barcelona, Spain 1,313,961,210
Protease inhibitor cocktail Set III Millipore, Darmstadt, Germany 535140
Trizma Base Sigma, St. Louis, MO, USA T1503
Tris-HCl Pancreac Química SL, Barcelona, Spain 1,236,541,209
Triton X-100 Sigma, St. Louis, MO, USA X100
SDS Sigma, St. Louis, MO, USA L3771
Glycerol Sigma, St. Louis, MO, USA G5516
Bromophenol Blue Pancreac Química SL, Barcelona, Spain 1,311,651,604
Dithiothreitol Sigma, St. Louis, MO, USA D0632
Tween 20 Sigma, St. Louis, MO, USA P2287
Non fat dry milk
NaCl Pancreac Química SL, Barcelona, Spain 1,216,591,211
KCl Pancreac Química SL, Barcelona, Spain 1,314,941,210
KH2PO4 Merck 4873
Na2HPO4 Pancreac Química SL, Barcelona, Spain 1,316,781,211
Basic 20 pH Crison, Alella, Spain
Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer VWR, Radnor, PA, USA.
Ultra-Clear Tubes (14x89mm) Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona 344059 Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.
Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K Merck Millipore, Darmstadt, Germany UFC901008
Centrifuge 5430R Eppendorf, Hamburgo, Germany
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona
Sonifier 250 Branson, Danbury, Connecticut
Amersham Imager 600 GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain
Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm VWR, Radnor, PA, USA 612-1702
Compact Balance EK-610 A&D, Tokyo, Japan
Pierce™ BCA Protein Assay Kit Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA
SuperSignal west pico chemiluminescent substrate Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA
GR 200 Precision Balance A&D, Tokyo, Japan
Anti-GPR37 Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 μg/mL
Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin Abcam, Cambridge, United Kingdom Primary antibodies diluted 1:10,000
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. Secondary antibody diluted 1:10,000
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. Secondary antibody diluted 1:30,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).
  2. Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. The fine structure of the nervous system. , Oxford University Press. New York. (1991).
  3. Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
  4. Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
  5. Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
  6. Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
  7. Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neuroscience. 132, 893-903 (2005).
  8. Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
  9. Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
  10. Lopes, J. P., et al. The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
  11. Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
  12. Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
  13. Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
  14. Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
  15. Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
  16. Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
  17. Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
  18. Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).

Tags

Bioquímica Edição 123 sinaptossomas localização sub-sináptica fracionamento de membrana sinapses
Fracionamento de Membranas Cerebrais: Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem para Avaliar a Localização de Proteínas Subinápticas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morató, X., López-Cano,… More

Morató, X., López-Cano, M., Canas, P. M., Cunha, R. A., Ciruela, F. Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization. J. Vis. Exp. (123), e55661, doi:10.3791/55661 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter