Summary
Här presenterar vi ett hjärnmembranfraktioneringsprotokoll som representerar ett robust förfarande för att isolera proteiner som hör till olika synaptiska fack.
Abstract
Bedömning av den synaptiska proteinkompositionen och funktionen utgör en viktig utmaning inom neurovetenskap. Det är emellertid inte lätt att utvärdera neurotransmission som inträffar inom synapser eftersom den är högt reglerad av dynamiska protein-protein-interaktioner och fosforyleringshändelser. Följaktligen, när någon metod används för att studera synaptisk överföring, är ett viktigt mål att bevara dessa övergående fysiologiska modifieringar. Här presenterar vi ett hjärnmembranfraktioneringsprotokoll som representerar ett robust förfarande för att isolera proteiner som hör till olika synaptiska fack. Med andra ord beskriver protokollet en biokemisk metod för att utföra proteinberikning från presynaptiska, postsynaptiska och extrasynaptiska fack. Först erhålles synaptosomer eller synaptiska terminaler från neuroner som innehåller alla synaptiska fack med hjälp av en diskontinuerlig sackarosgradient. Av anmärkningen är kvaliteten på denna initiala synaptiska membranberedningen critical. Därefter uppnås isoleringen av de olika subsynaptiska facken med lätt solubilisering med användning av milda tvättmedel vid olika pH-betingelser. Detta möjliggör separation genom gradient och isopyknisk centrifugering. Slutligen valideras proteinanrikning vid de olika subsynaptiska facken ( dvs. pre-, post- och extrasynaptiska membranfraktioner) genom immunoblotanalys med användning av väl karakteriserade synaptiska proteinmarkörer ( dvs. SNAP-25, PSD-95 och synaptofysin, Respektive), vilket möjliggör en direkt bedömning av den synaptiska fördelningen av något särskilt neuronalt protein.
Introduction
Synaptisk överföring bygger på synaps fysiska integritet, ett koncept som förutsågs 1897 av Foster and Sherrington 1 . Således är förståelse för distributionen av centrala neurotransmissionskomponenter ( t.ex. jonkanaler, receptorer, etc. ) avgörande för att belysa synaptisk funktion, både i normala och patologiska tillstånd. Elektronmikroskopi (EM) har bidragit enormt till den nuvarande ultrastrukturella uppfattningen av prototypiska nervsystemet (CNS) synapser. På så sätt har EM definierat finkopplingen mellan pre- och postsynaptiska densiteter, vilka separeras av en klyft av ett ganska jämnt avstånd (~ 25 nm) 2 . Intressant är att den postsynaptiska apparaten uppvisar en relativt kontinuerlig, elektrontät förtjockning under dess plasmamembran, den så kallade postsynaptiska densiteten eller PSD 2 . Omvänt, vid den presynaptiska apparaten, en märkningsblankettEtt diskontinuerligt cytomatrixnätverk är anordnat strax under plasmamembranet, vilket är väsentligt för inriktningen och dockningen av synaptiska vesiklar till den aktiva aktiva zonen 3 för plasmamembran. EM utgör därför det gyllene experimentella sättet att undersöka fördelningen av proteiner inom strukturellt bevarade CNS-synapser. Emellertid är informationen som tillhandahålls av elektronmikrografer statisk. Faktum är att ackumulerande bevis visar att in vivo synapser är extremt dynamiska och upplever därmed dramatiska strukturella förändringar vid hållbar synaptisk överföring. Dessutom kan morfologin och sammansättningen av synapser förändras genom olika CNS-områden och på utveckling, mognad, åldrande och utveckling av neuropatologiska tillstånd. Sammantaget representerar ett protokoll som fokuserar på att isolera proteiner som hör till olika synaptiska fack i fysiologiska förhållanden ett värdefullt verktyg för en mer omfattande studie av synaptisk funktion.
et al . (2001) 4 , baseras på en pH-skift som försvagar de adhesiva interaktionerna som förekommer inom den pre- och postsynaptiska apparaten. För det första är det möjligt att använda lätta tvättmedel vid pH 6,0, det är möjligt att urskilja bindemedelsförbindelsen som håller den för- och postsynaptiska apparaten och som upprätthålls från den extrasynaptiska membrantomänen, vilken är solubiliserad och sålunda kan extraheras från de synaptiska kontakterna. Därefter försämras pH-värdet från 6,0 till 8,0 i närvaro av milda rengöringsmedel styrkan hos bindemedelsförbindelsen som håller den presynaptiska aktiva zonen tätt bunden till den postsynaptiska densiteten. Det presynaptiska facket är således detLubiliseras och kan separeras från den postsynaptiska densiteten, vilken för det mesta bevaras eftersom koncentrationen av detergent som används inte främjar solubiliseringen 4 . Intressant kan fraktioneringseffektiviteten, så småningom högre än 90%, bekräftas av olika subsynaptiska markörer: i ) synaptosomalt associerat protein 25 (SNAP-25) från den presynaptiska aktiva zonen; Ii ) synaptofysin, från den extrasynaptiska fraktionen ( dvs utanför den aktiva zonen och innefattande mikrosomer); Och iii ) postsynaptisk densitetsprotein 95 (PSD-95), från den postsynaptiska densiteten. I synnerhet har denna hjärnmembranfraktioneringsmetod använts framgångsrikt. Följaktligen har det varit möjligt att exakt bestämma den subsynaptiska lokaliseringen av olika receptorer, såsom alfa-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) receptorer 5 , adenosin Al receptor (AiR) 6 ,Adenosin A 2A- receptor (A 2A R) 7 , adenosintrifosfat (ATP) P2-receptorer 8 , nikotin-acetylkolinreceptor-subenheter 9 och Parkinsons sjukdom-associerad receptor GPR37 10 . Ett antal begränsningar kan emellertid hindra korrekt bedömning av den synaptiska fördelningen av ett visst neuronalt protein. I det här förfarandet beskriver vi inte bara hela protokollet, utan vi lyfter också fram några kritiska punkter som ska beaktas, såsom den ganska stora mängden vävnad som behövs, lågproteinutbytet och det obligatoriska kravet att validera effektiviteten hos Varje separation innan du utför det bestämda experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsöksprocedurer godkändes av universitetet i Barcelona kommittén för djuranvändning och omsorg (CEEA) i enlighet med riktlinjerna som beskrivs i handledningen för vård och användning av laboratoriedjur 11 och efter Europeiska gemenskapen, lag 86/609 / CCE, FELASA och ARRIVE riktlinjer. Således är möss inrymda i standardburar, med ad libitumåtkomst till mat och vatten, och bibehålls under kontrollerade standardbetingelser (12 h mörk / ljuscykel från 7:30, 22 ° C och 66% fuktighet).
1. Erhålla musharts synaptosomer med användning av en diskontinuerlig sackarosgradient
Obs! Denna metod rapporterades tidigare 10 .
- Förbered färsk isoleringsbuffert (IB), pH 7,4; 2 M sackaros; 1 M sackaros / 0,1 mM CaCl2; Och 0,1 mM CaCl2 (se tabell 1 ). Kyl lösningarna på is.
- SaCrifice fem möss genom cervikal dislokation. Dekapitera och snabbt avlägsna hjärnan hos varje djur. Dissektera hjärnregionen av intresse (dvs. hippocampusen, 0,25-0,35 g färsk vävnad) och placera den i ett 5 ml Potter-Elvehjem glasrör på is med 1 ml IB.
- Homogenisera vävnaden med hjälp av en homogeniserande omrörare (10 slag vid 700-900 rotationer per minut), företrädesvis i ett isbad för att förhindra provuppvärmning.
- Placera den homogeniserade vävnaden (1 ml) i ett 15 ml rör innehållande 6 ml 2 M sackaros och 2,5 ml 0,1 mM CaCl2 vid 4 ° C. Blanda långsamt genom att invertera röret.
Obs: Tillägget av kalcium är väsentligt för att upprätthålla bindemedelsinteraktionerna mellan organeller och därigenom att bevara strukturen hos de olika "densiteterna". - Placera lösningen i ett 12 ml centrifugrör och tillsätt långsamt 2,5 ml 1 M sackaros / 0,1 mM CaCl2 ovanpå varje rör för att bilda sackarosgradienten.
Obs! Märk positionen oF gradientgränssnittet på centrifugröret med en permanent markör. - Väg och ekvilibrera centrifugrören med IB-lösningen i sina motsvarande stålstöd och med sina luckor.
- Centrifugera rören i 3 h vid 100 000 x g och 4 ° C med en rotationscentrifug med svängande skopor. Fyll helt rotorn med alla stålstöd (tom tom, om det behövs).
- Kassera det övre skiktet innehållande myelin. Med en Pasteur pipette samlar du den vita ringen mellan 1,25-M och 1-M sackaros interfas som motsvarar synaptosomfraktionen.
- Späd synaptosomerna med 9X volymen med IB i ett centrifugrör.
- Väg och ekvilibrera centrifugrören med IB-lösningen i sina motsvarande stålstöd och med sina luckor.
- Centrifugera rören i 30 minuter vid 15 000 x g och 4 ° C med en rotationscentrifug med svängande skopor.
- Kassera supernatanten och resuspendera thPelleten med 1,1 ml IB-lösning. Samla 100 μL av denna synaptosomala lösning och centrifugera i 5 min vid 11 000 x g och 4 ºC.
- Resuspendera synaptosomalpelleten i 5% natriumdodecylsulfat (SDS) och förvara detta prov vid -20 ºC.
Obs: Detta prov kommer att motsvara den totala synaptosomfraktionen för ytterligare Western-blot-analys. Den återstående synaptosomala fraktionen (~ 1 ml) kan antingen frysas ner vid -20 ºC tills den används eller behandlas för efterföljande subsynaptisk fraktionering. Synaptosomerna eller renade synapser representerar mellan 1 och 2% av den totala hippocampala volymen 12 .
2. För-, post- och extrasynaptisk isolering
- Förbered 2x frisk solubiliseringsbuffert, pH 6,0; 1x solubiliseringsbuffert, pH 6,0; Solubiliseringsbuffert, pH 8,0; Och 0,1 mM CaCl2 (se tabell 1 ). Kyl lösningarna på is.
Obs: pH-värdet för dessa lösningar bör vara exaktY justeras för att uppnå en bra subsynaptisk fraktionering. - Torka långsamt den 1-ml resuspenderade synaptosomala fraktionen (se steg 1.12) med 5 ml 0,1 mM CaCl2.
- Tillsätt samma volym (5 ml) iskall 2x solubiliseringsbuffert, pH 6,0 och inkubera i 50 minuter på is under hög omröring i en bägare på is.
Obs! Medan 1% Triton X-100 vid pH 6,0 solubiliserar alla plasmamembranproteiner, bevarar den proteiner i synaptiska kontakter eller korsningar ( dvs pre- och postsynaptiska strukturer) 4 . - Placera lösningen i ett centrifugrör. Väg och ekvilibrera rören med ekvivalenta volymer 0,1 mM CaCl2 och 2x solubiliseringsbuffertlösning, pH 6,0, inom sina motsvarande stålstöd och med sina stängningslock.
- Centrifugera rören i 30 minuter vid 40 000 x g och 4 ° C med hjälp av en svängande skoprotorscentrifug. Den erhållna supernatanten representerar den extrasynaptiska fraktionen,Och pelleten motsvarar de synaptiska korsningarna ( dvs pre- och postsynaptiska fraktioner).
- Koncentrera supernatanten innehållande extrasynaptisk fraktion till en slutlig 200 | il volym med användning av ett 15 ml 10K filterrör centrifugerat vid 4000 xg och 4 ° C.
- Precipitera den resulterande koncentrerade extrasynaptiska fraktionen (200 pl) med 5 volymer (1 ml) förkyld (-20 ° C) aceton över natten vid -20 ° C.
- Nästa dag, centrifugera den extrasynaptiska fraktionen under 30 minuter vid 18 000 x g och -15 ° C. Efter centrifugering kasseras acetonsupernatanten och torka pelleten för att avlägsna eventuellt spår av aceton.
- Slutligen, resuspendera pelleten innehållande extrasynaptiska proteiner med 200 | il 5% SDS. Sonikera pelleten, om det behövs.
- Utan att störa det, tvätta försiktigt pelleten innehållande pre- och postsynaptiska fraktioner med 2 ml 1x solubiliseringsbuffert, pH 6,0. Kassera bufferten.
- ResuspenderaPelleten med 10 ml 1x solubiliseringsbuffert, pH 8,0, med användning av en glaspasteurpipett.
Obs! Medan 1% Triton X-100 vid pH 8,0 solubiliserar den presynaptiska specialiseringen bevaras den olösliga postsynaptiska densiteten 4 . - Inkubera suspensionen i 50 minuter på is under hög omröring i en bägare på is.
- Placera lösningen i ett centrifugrör. Väg och ekvilibrera rören med 1x solubiliseringsbuffertlösning, pH 8,0, inom sina motsvarande stålstöd och med sina luckor.
- Centrifugera rören i 30 minuter vid 40 000 x g och 4 ° C med hjälp av en svängande skoprotorscentrifug; Den erhållna supernatanten motsvarar den presynaptiska fraktionen och pelleten till den postsynaptiska fraktionen.
- Bearbeta supernatanten innehållande presynaptisk fraktion, som beskrivs i steg 2.6-2.9.
- Resuspendera pelletsinnehållande postsynaptisk fraktion med 200 | il 5% SDS. Sonikera pelleten, iF krävs.
3. Analysera proven genom immunoblot för att validera membranfraktionering
- Bestäm mängden protein i varje fraktion ( dvs de totala extra-, pre- och postsynaptiska fraktionerna) med användning av bicinchoninsyraproteinanalysen.
- Ta 20 μg protein från varje fraktion och späd det till en slutlig volym av 50 μl i SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) provbuffert. Koka i 5 minuter vid 100 ºC.
- Separera proteinerna med SDS-PAGE elektrofores 10%, med en 4% koncentrerande gel under reducerande betingelser. Elektrofores vid konstant spänning på 80 V tills färgen kommer in i den nedre gelén och ökar sedan spänningen till 120 V.
- Överför proteinerna till ett PVDF-membran och blockera med IB-blockeringslösning under 45 minuter vid rumstemperatur under kontinuerlig skakning.
- Inkubera membranet över natten vid 4 ºC med den angivna primära antikroppen ( dvs. anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-synaptofysin eller anti-GPR37) utspätt i IB-blockeringslösning under kontinuerlig skakning.
- Tvätta membranet tre gånger (10 min vardera) med IB tvättlösning för att eliminera obundet primär antikropp.
- Inkubera med den angivna sekundära antikroppen under 90 minuter i mörka förhållanden vid rumstemperatur under kontinuerlig skakning.
- Tvätta membranet tre gånger (10 min vardera) med IB tvättlösning för att eliminera obundet sekundär antikropp.
- Inkubera membranet med kemiluminescerande substrat (förbered blandningen under mörka förhållanden och följ 1: 1-delen av lösning A och B från tillverkaren).
- Analysera membranet i en kemiluminescerande detekteringsanordning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrivna metoden har i stor utsträckning använts för subsynaptisk analys av neuronala proteiner i allmänhet och för isolering och biokemisk karakterisering av synaptiska receptorer 5 , 6 , 7 , 8 , 9 i synnerhet. Intressant är att det representativa resultatet som visas här visar användbarheten av detta experimentella förfarande för analys av den subsynaptiska hippocampala fördelningen av en föräldralös G-proteinkopplad receptor, nämligen Parkinsons sjukdomsassocierad receptor GPR37 10 . GPR37 identifierades ursprungligen genom sökningar efter homologer för endotelin och bombesinreceptorer 13 , fastän det visade sig inte binda till endoteliner eller besläktade peptider. På sin plats föreslogs GPR37 att aktiveras av huvudaktivatorn pEptid 14 , 15 , 16 och nyligen av neuropeptiderna prosaposin och prosaptid 17 , fastän dessa föreningar ännu inte är universellt accepterade. GPR37 har fått mest uppmärksamhet för dess koppling till Parkinsons sjukdom 18 . Således är det väsentligt intresse att känna till neurobiologin hos denna spännande receptor, både under normala och patologiska förhållanden. Därför kan upptäcka GPR37-subsynaptisk lokalisering bidra till att klargöra sin funktion i hjärnan. För detta ändamål isolerades hippocampus först från C57BL / 6J (WT) och GPR37-KO-möss vid åtta veckors ålder. Därefter renades extra-, pre- och postsynsynaptiska fraktioner med användning av membranfraktioneringsprotokollet (se figur 1 för en schematisk översikt över proceduren). Därefter verifierades renheterna hos dessa subsynaptiska facken avSegregering av respektive synaptiska markörer: i ) extrasynaptisk vesikulär markör (synaptofysin); Ii ) den presynaptiska aktiva zonmarkören (SNAP-25); Och iii ) postsynaptisk densitetsmarkör (PSD95). Följaktligen analyserades berikningarna i synaptofysin, SNAP-25 och PSD95 inom de extra-, pre- och post-subsynaptiska fraktionerna genom immunoblot med användning av specifika antikroppar mot dessa proteiner ( Figur 2 ). Följaktligen fann man en fraktioneringseffektivitet av minst 90% för varje synaptisk markör testad ( Figur 3 ), liknande de som beskrivits tidigare 6 . Intressant var att GPR37-immunreaktiviteten var rikligare (n = 3; P <0,001) i den extrasynaptiska fraktionen när den jämfördes med de preynaptiska (20 ± 4%) och de postsynaptiska (36 ± 2%) fraktionerna ( Figur 3 ). Dessutom indikerar våra data att, medan närvarande i den presynaptiska aktiva zonen, var GPR37 huvudsakligen loKalibrerad i postsynaptisk densitet (n = 3; P <0,05) ( Figur 3 ). Sammantaget tilläts hjärnmembranfraktioneringsprotokollet för bedömningen av den subsynaptiska fördelningen av GPR37 i mushippocampus, vilket således ger värdefull information för framtida manipuleringar av denna orphanreceptor.
Figur 1: Schematisk flödesdiagram representation av membranfraktioneringsprotokollet. Alla försöksförfaranden beskrivs i den vänstra kolumnen, medan provsamlingen visas i högra kolumnen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur2: Subsynaptisk fördelning av GPR37 i mushippocampus. Representativ immunoblot som visar synaptofysin, SNAP-25 och PSD-95 som extra-, pre- och postsynaptiska specifika synaptiska markörer, såväl som GPR37-immunoreaktivitet i hippocampala synaptiska fraktioner av WT- och GPR37-KO-möss. Hippokampala synaptosomer (Syn) fraktionerades till extrasynaptiska (Extra) och presynaptiska (Pre) aktiva zoner och postsynaptiska densitet (Post) -fraktioner. Dessa analyserades med immunoblot (20 | ig protein / bana) med användning av kanin-anti-synaptofysinet (1: 3 000), mus anti-SNAP-25 (1: 3000), kanin anti-PSD95 (1: 3000) och kanin anti -GPR37 (1 | ig / ml) antikroppar. Den primära bundna antikroppen detekterades med användning av antingen en HRP-konjugerad get anti-kanin (1/30 000) eller en antikropp mot kanin (1: 30 000). Dessa data extraheras från referens 10 , med tillstånd. Vänligen klicka hEre att se en större version av denna figur.
Figur 3: Relativ kvantifiering av GPR37-anrikning i hippokampala extra-, pre- och postsynaptiska fraktioner. Intensiteten hos de immunreaktiva banden på immunoblottade membran motsvarande extrasynaptisk (extra, gul kolonn), presynaptisk (Pre, grön kolonn) och postsynaptisk (Post, röd kolonn) fraktioner, som visas i Figur 2, mättes genom densitometrisk avsökning. Tätheten kvantifierades från icke-mättade band. Värden normaliserades (i% av den relativa densitometriska avsökningen, RDS) med användning av mängden Synaptophysin, SNAP-25, PSD95 och GPR37 i den mest berikade fraktionen och presenterades som medel ± SEM av tre oberoende experiment 10 . Asteriskerna anger betydligt olika data: * p <0,05, *** p <0.001 (1-vägs ANOVA med ett Bonferronis post-hoc- test). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Ministerio de Economia y Competitividad / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 och PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 ), Och Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie (SBO-140028) till FC, X. M, VF-D och FC tillhör också den ackrediterade forskningsgruppen "Neuropharmacology and Pain" (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Arbetet stöddes också av "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras" från CAPES (Brasilien) till FC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 μg/mL | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10,000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10,000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30,000 |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. The fine structure of the nervous system. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neuroscience. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).
