نظام متكامل لتشغيل عن بعد توصيل الإشارة داخل الخلايا بوساطة نانوحبيبات Upconversion كيناز فوتواكتيفيشن
Summary
في هذا البروتوكول، معطلة على سطح نانوحبيبات محبوس البروتين كيناز ألف (PKA)، بيوفيكتور توصيل إشارات خلوية، وميكروينجيكتيد إلى سيتوسول وتفعيلها من خلال تحويل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة من الإشعاع (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء، الذي يحفز الإجهاد المصب تفكك الألياف في سيتوسول.
Abstract
نانوحبيبات Upconversion (أوكنب)-فوتواكتيفيشن الوساطة نهج جديد في بيوفيكتورس التحكم عن بعد مع الضيائية أقل بكثير وأعمق اختراق الأنسجة. ومع ذلك، الأجهزة الموجودة في السوق غير سهولة متوافق مع تطبيق upconversion. ولذلك، تعديل الصك متاحة تجارياً ضروري لهذا البحث. في هذه الورقة، ونحن أولاً توضيح التعديلات فلوريميتير التقليدية ومجهر الأسفار لجعلها متوافقة لتجارب upconversion فوتون. ثم يصف لنا توليف القرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد)-أثارت محبوس البروتين كيناز ألف الحفاز فرعية (PKA) معطلة في مجمع أوكنب. وأفيد أيضا معلمات microinjection وإجراءات الجرد فوتواكتيفيشن. بعد أن يتم ميكروينجيكتيد PKA-أوكنب محبوس في خلايا تنتجها الخلايا الليفية REF52، مشغلات تشعيع الجرد، وتفوق إلى حد كبير لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية التقليدية، كفاءة PKA المسار توصيل الإشارات في الخلايا الحية. وبالإضافة إلى ذلك، تؤكد تجارب التحكم الإيجابي والسلبي أن الطريق التي يسببها PKA مما يؤدي إلى تفكك ألياف الإجهاد على وجه التحديد يتم تشغيلها بواسطة تشعيع الجرد. وهكذا، يوفر استخدام أوكنب البروتين تعديل نهج مبتكر التحكم عن بعد بالتضمين في ضوء التجارب الخلوية، التي يجب تجنب التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية.
Introduction
وقد وضعت البروتينات المعدلة كيميائيا يمكن أن فوتواكتيفاتيد (مثلاً، PKA محبوس البروتينات) كحقل ناشئة في مجال البيولوجيا الكيميائية لمعالجة العمليات الكيميائية الحيوية بين الخلايا1،2 غير إينفاسيفيلي ،3. استخدام الضوء كما يوفر حافزا القرار الزمانية المكانية ممتازة عند تنشيط هذه محبوس البروتينات. ومع ذلك، يمكن أن يسبب ضوء الأشعة فوق البنفسجية التغييرات الشكلية غير مرغوب فيها، والمبرمج، وتلف الحمض النووي للخلايا4،5. ومن ثم، التطورات الأخيرة في التصميم مجموعات فوتوكاجينج تركز على تمكين فوتوكليفاجي عند الإثارة أطول الطول الموجي أو اثنين-فوتون لتقليل الضيائية، كذلك فيما يتعلق بزيادة التغلغل العميق الأنسجة6،7. تنشيط مجموعات حبس تستجيب للطول الموجي أطول مما يسمح لنا باختيار الأطوال الموجية أونكاجينج المناسبة (أي، قنوات) إلى بشكل انتقائي بيوفيكتورس عند اثنين أو أكثر الفئات كاجينج الحالي7. ونظرا لهذه الخصائص المفيدة، تطوير مجموعات جديدة من فوتوكاجينج الضوء الأحمر عمل المنبع هام جداً في منهجيات الضوئية للدراسات البيولوجية بدءاً من سبر آليات ردود الفعل على مراقبة الأنشطة الخلوية8. ومع ذلك، مجموعة كاجينج اثنين-فوتون عادة مسعور جداً بسبب هيكل حلقة عطرية تنصهر فيها، ومجموعة كاجينج الضوء المرئي عادة الفلزية العضوية، مع يغاندس العطرية. هذه الخاصية العطرية/عمود المصباح غير مناسبة عندما يكون بيوفيكتور البروتين أو الإنزيم، كما ديناتوريس الموقع تنشيط الإنزيم/البروتين ويسبب فقدان وظيفة، حتى لو كان التصريف والتحلل الضوئي لا تزال تعمل على مستوى المواد الكيميائية2 ،9.
أوكنبس هي محولات الطاقة الفعالة التي تحول على ضوء الإثارة الجرد بالأشعة فوق البنفسجية. وقد عرضت هذه الخاصية الفريدة والرائعة من أوكنبس قرارات واقعية للتصدي للتحديات المرتبطة فوتواكتيفيشن وتشغيل الإصدار التي تسيطر عليها من الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك10من حمض الفوليك، سيسبلاتين مشتقات11 ،12الحمض النووي/siRNA و حويصلات كوبوليمر13والجسيمات أجوف14. ومع ذلك، على حد علمنا، فوتواكتيفيشن أوكنب–بمساعدة من الإنزيمات أو البروتينات لم يتم اختباره حتى الآن. لأنه لا توجد أي حالة ناجحة لاستخدام الضوء الأحمر أو قوائم الجرد الوطنية فوتواكتيفي إنزيم، نحن كانت تطالب بإجراء التنشيط آثار تقرير الجرد الوطني لبناء البروتين/إنزيم تتألف من مجمعات إنزيم محبوس معدلة كيميائيا مع السليكا المغلفة، لانثانيدات يخدر أوكنب15. في هذه الدراسة، أوكنب كان مترافق مع سرعة في رد فعل إشارة توصيل كيناز في شكل قفص PKA. يتحكم PKA توليف الجليكوجين والتنظيم سيتوسكيليتال يستجيب للمنبهات الخارجية عن طريق دوري أدينوسين الفوسفات (معسكر) التنظيم في سيتوسول16. علينا دراسة جدوى لتنشيط إنزيم في الخلق الزماني والمكاني في تجربة الهاتف خلوي بعد التشعيع الجرد. هذا المنبر فوتواكتيفيشن أوكنب-بمساعدة منهجية جديدة إلى فوتواكتيفاتي إنزيم استخدام قوائم الجرد الوطنية ويتجنب استجابة الخلايا الناجم عن إشعاع الأشعة فوق البنفسجية التقليدية2،4توصيل إشارة غير مرغوب فيها.
من الصعب جداً ترانسلوكاتي بيوفيكتورس كبيرة (مثلاً، البروتينات) عبر غشاء الخلية للتحكم في النشاط الخلوي. على الرغم من أن قد يكون من الأسهل ترانسلوكاتي عن طريق الالتقام في سيتوسول البروتين الجسيمات معطلة، قد تضررت الالتقام أو المتدهورة عن طريق فخ اندوسومال وما يترتب عليه من تدهور الليزوزومية2،4. مبالغ ذوبانها حتى لو البروتين محبوس الفنية لا تزال بعد الغشاء إزفاء، قد لا يكون كافياً لإحداث الاستجابة الخلوية2،17. في تناقض حاد، microinjection نهجاً مباشرا والكمية لتسليم بيوفيكتورس الكبيرة إلى السيتوبلازم للخلية. وعلاوة على ذلك، يتطلب المعطل تداولها أوكنب بيوفيكتور تحويل الضوء لتفعيلها. ولذلك، الأجهزة البصرية يتطلب المزيد من التعديل لقياس، تصور، والاستفادة من الضوء upconversion. وسيرد في هذا العمل، تسليم مجمع أوكنب PKA محبوس إلى خلية باستخدام microinjection والتعديلات الأساسية التالية التحليل الطيفي، والفحص المجهري نير فوتواكتيفيشن بالتفصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
سابقا، هوفمان وزملاء العمل وجدت أن التغييرات الشكلية المثيرة وقد لوحظت في الخلايا REF52 بعد microinjection PKA الحرة19. وفي دراسة أخرى، أن المجموعة لورانس أثبتت أن PKA محبوس يمكن تفعيلها في فيفو، مما يؤدي إلى التغييرات الشكلية وتفكك ألياف الإجهاد عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية التح…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر العلم نانو وبرنامج التكنولوجيا من سينيكا ووزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان للتمويل (101-2113-M-001-001-MY2؛ 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Reagent | |||
| Tris(hydorxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Amomonium hydroxide (28%-30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 ml | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Novabiochem | 8.51082.0005 | |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12000-14000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscopy | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
Referências
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of “Caged” and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -. D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells – Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
