Un système intégré pour déclencher à distance Transduction de signaux intracellulaires par Photoactivation Kinase induite par l’Upconversion Nanoparticle
Summary
Dans ce protocole, “cage” protéine kinase A (PKA), un bioeffector de transduction du signal cellulaire, a été immobilisé sur une surface de nanoparticules, micro dans le cytosol et activé par l’upconvertis UV lumière par irradiation de proche infrarouge (NIR), induisant désintégration de fibre stress en aval dans le cytosol.
Abstract
Nanoparticules de conversion ascendante (UCNP)-médiation photoactivation est une nouvelle approche de contrôle à distance des bioeffectors beaucoup moins phototoxicité et avec une pénétration plus profonde des tissus. Toutefois, les instruments existants sur le marché ne sont pas difficilement compatibles avec l’application de conversion ascendante. Par conséquent, modifier l’instrument disponible dans le commerce est essentiel pour cette recherche. Dans cet article, nous illustrons tout d’abord les modifications d’un fluorimètre conventionnel et le microscope à fluorescence pour les rendre compatibles pour des expériences de conversion ascendante de photon. Nous décrivons ensuite la synthèse d’un proche infrarouge (NIR)-a déclenché la sous-unité catalytique kinase A (PKA) de “cage” protéine immobilisé sur un complexe UCNP. On rapporte également les paramètres pour microinjection et procédures de photoactivation NIR. Après que la “cage” PKA-UCNP est microinjected dans les cellules de fibroblaste de REF52, l’irradiation de NIR, qui est nettement supérieure à une irradiation UV classique, déclenche efficacement la voie de transduction de signal PKA dans les cellules vivantes. En outre, les expériences positives et négatives de témoins confirment que la voie induite par la PKA menant à la désintégration des fibres de stress est spécifiquement déclenchée par une irradiation NIR. Ainsi, l’utilisation de protéines modifiées UCNP fournit une approche novatrice pour contrôler à distance les expériences cellulaires lumière modulée, dans lequel une exposition directe aux rayons ultraviolets doit être évitée.
Introduction
Modifiés chimiquement les protéines qui peuvent être photoactivées (par exemple, les protéines PKA en cage) ont été développés dans un domaine émergent en biologie chimique à manipuler non invasive des processus biochimiques intercellulaire1,2 ,3. En utilisant la lumière comme un stimulus offre une résolution spatio-temporelle excellente lors de l’activation de ces protéines mis en cage. Toutefois, lumière UV peut causer intempestif des changements morphologiques, l’apoptose et dommages à l’ADN de cellules4,5. Par conséquent, des développements récents dans la conception des groupes photocaging se concentrent sur permettant photoclivage à excitation biphotonique ou de plus longues longueurs d’onde pour réduire la phototoxicité, ainsi qu’à accroître la pénétration profonde des tissus6,7. Mise en cage des groupes qui répondent aux plus longue longueur d’onde, ce qui nous permet de choisir adaptés libération longueurs d’onde (c.-à-d., canaux) à sélectivement activer bioeffectors lorsque deux ou plus groupes mise en cage sont présents7. Compte tenu de ces caractéristiques utiles, développer de nouveaux groupes de feux rouges photocaging est très important travail en amont des méthodes photochimiques pour des études biologiques allant de sonder les mécanismes des réactions à la maîtrise des activités cellulaires8. Néanmoins, un groupe de mise en cage de deux photons est normalement trop hydrophobe en raison de la structure de fondu aromatique et un groupe de mise en cage de lumière visible est normalement organométallique, avec des ligands aromatiques. Cette propriété hydrophobe/aromatique n’est pas adaptée quand le bioeffector est une protéine ou une enzyme, car elle dénature le site de l’activation de l’enzyme/protéines et provoque une perte de fonction, même si la conjugaison et la photolyse fonctionnent toujours sur le plan chimique2 ,,9.
UCNPs sont des transducteurs efficaces qui convertissent la lumière d’excitation NIR aux UV. Cette propriété unique et fascinante de UCNPs a offert des résolutions réalistes pour relever les défis associés à photoactivation et déclenchement la libération contrôlée de petites molécules, dont10de l’acide folique, cisplatine, dérivés11 ,12, copolymère vésicules13et particules creuses14ADN/siARN. Cependant, au meilleur de nos connaissances, la photoactivation UCNP assistée d’enzymes ou protéines n’a pas été testée jusqu’à présent. Parce qu’il n’y a aucun cas de réussite de l’utilisation de lumière rouge ou NIR à photoactifs une enzyme, nous a invités à procéder à l’activation déclenchée NIR d’une structure de protéine/enzyme composée de complexes enzyme “cage” chimiquement modifiée avec un enrobées de silice, lanthanide dopé UCNP15. Dans cette étude, la UCNP était conjugué avec une kinase de transduction de signal rapidement réagir sous forme de “cage” PKA. PKA contrôle la synthèse du glycogène et la régulation du cytosquelette qui répond à des stimuli externes par l’intermédiaire de règlement de phosphate (cAMP) de l’adénosine cyclique dans le cytosol16. Nous avons étudié la faisabilité de l’activation de l’enzyme dans les mœurs temporelles et spatiales dans une expérience cellulaire après irradiation NIR. Cette plate-forme de photoactivation assistée par UCNP est une nouvelle méthodologie pour photoactivate une enzyme à l’aide de NIR et évite la réponse de transduction de signal indésiré de cellules causés par conventionnel UV irradiation2,4.
Il est très difficile d’effectuer des transferts bioeffectors grand (p. ex., protéines) à travers la membrane cellulaire pour contrôler l’activité cellulaire. Bien qu’immobilisé particule protéique peut être plus facile d’effectuer des transferts par endocytose dans le cytosol, endocytose peut-être être endommagé ou dégradé via endosomale provocation policière et la dégradation lysosomiale conséquente2,4. Même si la protéine “cage” fonctionne toujours après la translocation de la membrane, les montants transférés ne suffisent pas pour déclencher la réaction cellulaire2,17. Contraste, microinjection est une approche directe et quantitative pour livrer des grands bioeffectors dans le cytoplasme de la cellule. En outre, bioeffector UCNP-immobilisé nécessite upconvertis lumière d’être activé. Par conséquent, l’instrumentation optique nécessite encore une modification de mesurer, visualiser et d’utiliser la lumière upconversion. Dans ce travail, la livraison d’un complexe de PKA-UCNP en cage dans une cellule à l’aide de la microinjection et les modifications essentielles suivantes en microscopie et spectroscopie pour NIR photoactivation sera décrite en détail.
Protocol
Representative Results
Discussion
Auparavant, Hofmann et ses collaborateurs ont trouvé que des changements morphologiques spectaculaires ont été observés dans les cellules de REF52 après la microinjection des PKA libre19. Dans une autre étude, le groupe de Lawrence a démontré que le PKA en cage peut être activé en vivo, conduisant à des changements morphologiques et la désintégration des fibres de stress lorsqu’ils sont soumis aux UV photolyse20. Rapports précédents sur l’exploit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la Nano sciences et technologie Programme de l’Academia Sinica et le ministère des sciences et de technologie de Taiwan pour le financement (101-2113-M-001-001-MY2 ; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Reagent | |||
| Tris(hydorxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Amomonium hydroxide (28%-30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 ml | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Novabiochem | 8.51082.0005 | |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12000-14000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscopy | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
Referências
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