Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem
Summary
Bu protokol için Kafesli protein kinaz A (PKA), hücresel sinyal iletim bioeffector bir nanopartikül yüzey üzerine immobilize sitozol microinjected ve upconverted UV yakın kızılötesi (Nur) ışınlama ışığı sayesinde inducing aşağı akım stres fiber dağılma sitozol içinde.
Abstract
Upconversion nanopartikül (UCNP)-aracılı photoactivation için uzaktan kontrol bioeffectors derin doku penetrasyon ile çok daha az fototoksisite ile yeni bir yaklaşımdır. Ancak, piyasada mevcut araçları kolayca upconversion uygulama ile uyumlu değildir. Bu nedenle, ticari araç değiştirerek bu araştırma için esastır. Bu yazıda, ilk geleneksel fluorimeter ve floresan mikroskop foton upconversion deneyler için uyumlu olmaları için değişiklikler göstermektedir. Biz o zaman bir yakın kızılötesi (Nur) sentezi tarif-UCNP kompleksi immobilize Kafesli protein kinaz A katalitik alt birimi (PKA) tetiklenir. Mikroenjeksiyon ve Nur photoactivation yordamlar için parametre de raporlanır. Kafesli PKA UCNP REF52 fibroblast hücreleri microinjected sonra geleneksel UV ışınlama için önemli ölçüde üstün olduğunu, NIR ışınlama PKA sinyal iletim yolu canlı hücreler içinde etkili bir şekilde tetikler. Buna ek olarak, pozitif ve negatif kontrol deneyleri stres lifleri dağılması için önde gelen PKA kaynaklı yolu özellikle NIR ışınlama tarafından tetiklenir onaylayın. Böylece, UCNP protein-modified kullanımı UV ışığı doğrudan maruz kaçınılmalıdır ışık modülasyonlu hücresel deneyler uzaktan denetlemek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Photoactivated (Örneğin, Kafesli PKA proteinler) olabilir kimyasal olarak değiştirilmiş proteinlerin kimyasal Biyolojide invaziv olmayan hücreler arası biyokimyasal süreçler1,2 işlemek için gelişmekte olan bir alanı olarak geliştirilmiştir ,3. Bunlar aktif hale getirildiğinde bir uyarıcı mükemmel kronolojik zamanmekansal çözünürlük sağlar gibi ışık kullanarak proteinler Kafesli. Ancak, UV ışığı istenmeyen morfolojik değişiklikler, Apoptozis ve DNA hasarı hücreleri4,5‘ e neden olabilir. Bu nedenle, tasarım son gelişmeler photocaging gruplarının photocleavage fototoksisite, de derin doku penetrasyonu6,7artırmak olarak azaltmak için dalga boyu daha uzun veya İki fotonlu uyarma üzerine etkinleştirme hakkında odaklan. Bioeffectors iki uzun dalgaboyu bize uygun uncaging dalga boylarında (Yani, kanalları) seçmek seçime bağlı olarak izin verdiği yanıt caging grupları etkinleştirmek veya mevcut7daha fazla caging gruplarıdır. Bu yararlı özellikleri göz önüne alındığında, yeni kırmızı ışık photocaging grupları ters yönde çalışmalarında çok önemli biyolojik araştırmalar reaksiyonlar hücresel aktiviteler8denetleme mekanizmalarının sondalama arasında değişen fotokimyasal yöntemleri geliştiriyor. Yine de, bir iki fotonlu caging normalde erimiş Aromatik halka yapısı nedeniyle çok hidrofobik grubudur ve görünür ışık caging ile aromatik ligandlar normalde Organometalik grubudur. Bu hidrofobik/aromatik özelliği etkinleştirme sitesi enzim/protein denatures ve fiil ve photolysis hala kimyasal düzeyde2 işe bile işlevi, kaybolmasına bioeffector bir protein veya enzim, ne zaman uygun değil ,9.
UCNPs Nur uyarma ışık UV için dönüştürmek etkili dönüştürücüler vardır. UCNPs bu benzersiz ve ilginç özelliği sorunları ele almak üzere gerçekçi kararlar photoactivation ile ilişkili ve kontrollü serbest bırakmak-in küçük moleküller, sisplatin türevleri11 folik asit10, dahil tetiklenen teklif etti , DNA/siRNA12, kopolimer veziküller13ve içi boş parçacıklar14. Ancak, bizim bilgi en iyi şekilde, proteinler ve enzimler UCNP destekli photoactivation defa test edilmemiştir. Kırmızı ışık veya NIR fotoaktif için bir enzim kullanarak başarılı bir dava yok çünkü biz kimyasal olarak değiştirilmiş Kafesli enzim kompleksi silis kaplı ile oluşan bir protein/enzim yapısı NIR tetiklemeli aktivasyonu gerçekleştirmek için istemde, UCNP15lanthanide katkılı. Bu çalışmada, UCNP bir hızla tepki sinyal iletim kinaz Kafesli PKA şeklinde ile Birleşik. PKA glikojen sentez ve siklik adenozin fosfat (kampı) yönetmelik sitozol16üzerinden dış uyaranlara yanıt hücre iskeleti düzenlenme denetler. Biz NIR ışınlama sonra hücresel bir deneyde zamansal ve mekansal davranış enzim harekete geçirmek fizibilite okudu. Bu photoactivation UCNP destekli platform photoactivate için yeni bir yöntem NIR kullanarak bir enzimdir ve geleneksel UV ışınlama2,4tarafından neden olduğu hücre istenmeyen sinyal iletim yanıtından önler.
Çok büyük bioeffectors translocate zordur (örneğin, proteinler) hücresel hareketlilik denetlemek için hücre zarı arasında. Parçacık immobilize protein endositoz ile sitozol translocate daha kolay olabilir, ancak endositoz bozulabilir veya endosomal tuzak ve bunun sonucunda lizozomal bozulması2,4yolu ile bozulmuş. Kafesli protein membran translocation sonra hala işlevsel olsa bile, translocated tutarları hücresel yanıt2,17tetiklemek için yeterli olmayabilir. Keskin aksine, mikroenjeksiyon büyük bioeffectors hücre sitoplazma için teslim etmek için bir doğrudan ve nicel bir yaklaşımdır. Ayrıca, UCNP etkisiz hale bioeffector upconverted ışık etkinleştirilmesini gerektirir. Bu nedenle, optik araçları daha fazla ölçmek, görselleştirmek ve upconversion ışık yararlanmak için değişiklik gerektirir. Bu çalışmada, kafese kapatılmış bir PKA-UCNP kompleksi teslim mikroenjeksiyon ve aşağıdaki temel spektroskopisi ve mikroskopi değişiklikleri için NIR photoactivation kullanarak bir hücreye ayrıntılı olarak açıklanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Daha önce Hofmann ve iş arkadaşlarınızla dramatik morfolojik değişiklikler ücretsiz PKA19mikroenjeksiyon sonra REF52 hücrelerde gözlendi buldum. Başka bir çalışmada, Lawrence grup Kafesli PKA vivo içindeharekete geçirmek, morfolojik değişiklikler ve UV photolysis20‘ ye tabi ne zaman stres lifleri dağılması olabilir gösterdi. Daha önce upconverted UV ışığı birkaç UCNP destekli, kafes, küçük moleküler bioeffectors21<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Nano bilim ve teknoloji programı Academia Sinica ve Bilim Bakanlığı ve Tayvan teknoloji finansman için (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2) teşekkür ederim.
Materials
| Reagent | |||
| Tris(hydorxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Amomonium hydroxide (28%-30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 ml | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Novabiochem | 8.51082.0005 | |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12000-14000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscopy | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
Referências
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of “Caged” and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -. D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells – Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
