キナーゼのアップコン バージョンのナノ粒子を介した光活性化によって細胞内シグナル伝達をリモートでトリガーする統合システム
Summary
このプロトコルではケージ プロテインキナーゼ A (PKA)、細胞信号伝達 bioeffector ナノ粒子表面に固定化した細胞質に microinjected、アップ コンバートされる紫外線近赤外線 (NIR) 照射からによって活性化を誘導します。細胞質の下流圧力繊維崩壊。
Abstract
アップコン バージョン ナノ粒子 (UCNP)-仲介された光はリモート コントロール bioeffectors はるかに少ない光毒性とより深いティッシュの浸透への新しいアプローチ。ただし、市場で既存のインストルメンテーションは容易にアップコン バージョンのアプリケーションとの互換性ではありません。したがって、市販の計測器を変更することは本研究のために不可欠です。この稿では、まず従来の蛍光の蛍光顕微鏡光子アップコン バージョン実験の互換性のために変更を示します。その後、近赤外線 (NIR) の合成について述べる-トリガー ケージ蛋白質キナーゼの触媒サブユニット (PKA) UCNP 複合体に固定化しました。マイクロインジェクションおよび近赤外光プロシージャのパラメーターも報告されています。ケージの PKA UCNP REF52 線維芽細胞に microinjected が、した後従来の UV 照射によりかなり優秀で、近赤外照射は効率的に細胞 PKA シグナル伝達経路をトリガーします。さらに、正と負の制御実験は、ストレスファイバーの崩壊につながる PKA 誘導経路が特に近赤外照射によってトリガーされることを確認します。したがって、蛋白質変更 UCNP の使用は、リモート光変調細胞実験、紫外線への直接露出を回避する必要がありますを制御する革新的なアプローチを提供します。
Introduction
センサー (PKA ケージ蛋白質など) をすることができます化学修飾されたタンパク質は細胞の生化学的なプロセス1,2 を非侵襲的操作する化学生物学の新たな分野として開発されています。、3。タンパク質をケージ使用光刺激はこれらの活性化と優れた時空間解像度を提供します。ただし、紫外線は、望ましくない形態学的変化、アポトーシスおよび細胞4,5への DNA 損傷を引き起こす可能性が。それ故に、photocaging グループの設計の最近の動向は、深部組織浸透6,7を増大させるため、同様の光毒性を軽減する長波長または 2 光子励起による電子スピンダイナミクスの有効化に焦点を当てます。私たちは適切な uncaging 神経波長 (すなわちチャンネル) を選択できるようにする選択的に波長が長く対応ケージのグループは bioeffectors 2 つをアクティブにしますより多くのケージ グループは、現在7。これらの便利な機能を与え、細胞活動8を制御するための反応のメカニズムを調査に至る生物学研究光化学的方法論で非常に重要な上流作業は、赤色光 photocaging の新しいグループを開発します。しかし、2 光子ケージ グループは縮合芳香環構造のためあまりにも疎水性通常、可視光ケージ グループは通常有機金属、芳香族配位子を。この疎水性/芳香族プロパティは適していません、bioeffector は蛋白質や酵素、酵素/タンパク質の活性化サイトを変化し、たとえ抱合と光分解はまだ2 の化学のレベルで動作、機能の損失が発生するとき ,9。
UCNPs は、近赤外励起光を UV に変換効果的なトランスデューサーです。UCNPs のこのユニークで魅力的なプロパティは、課題に対応する現実的な解像度 photoactivation に関連付けられているし、小分子、葉酸10シスプラチン誘導体11 の制御放出をトリガーに提供しています。、DNA/siRNA12、共重合体膜小胞13、および中空粒子14。ただし、我々 の知識の限り、酵素やタンパク質の UCNP シスト photoactivation 未テストところ。シリカ コーティングと化学修飾されたケージの酵素複合体から成るタンパク質/酵素コンストラクトの NIR トリガー活性化を実行する求められる私達を使って赤い光や近赤外光活性酵素の成功例がないので希土類をドープした UCNP の15。本研究では、UCNP は、ケージの PKA の形で急速に反応シグナル伝達キナーゼと共役だった。PKA は、グリコーゲン合成と細胞質16環状アデノシン リン酸 (キャンプ) 調節することによる外部からの刺激に応答する細胞骨格の調節をコントロールします。近赤外照射後の細胞実験で時空のマナーで酵素活性化の可能性を検討した.この光の UCNP 支援プラットフォーム NIR を使用して酵素 photoactivate する新しい方法であるし、従来 UV 照射2,4による細胞から不要な信号伝達応答を回避できます。
若し大 bioeffectors に非常に困難だ(例えば、蛋白質) 細胞の活動を制御する細胞膜を挟んだ。粒子を固定化したタンパク質は細胞質にエンドサイトーシスを介して若しやすくもありますが、エンドサイトーシスを破損やエンドソームわなに掛ける事とそれに伴うライソゾームの分解2,4を介して低下可能性があります。ケージのタンパク質が膜後まだ機能している場合でも転量が細胞応答2,17をトリガーするため十分ではないです。対照的に、マイクロインジェクションは細胞の細胞質に大規模な bioeffectors を提供する直接および定量的アプローチです。また、UCNP 固定化 bioeffector は、アクティブにするアップ コンバートされる光を必要とします。したがって、光学機器用はさらに変更を計測、可視化、およびアップコン バージョン光を利用する必要があります。この作品は、近赤外光用マイクロインジェクションと次の必須の分光法と顕微鏡の変更を使用してセルにケージ PKA UCNP 複合体の配信詳細に表示されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
以前は、ホフマンと同僚が見つかりました無料 PKA19のマイクロインジェクション後 REF52 細胞における劇的な形態学的変化を認めたこと。別の研究では、ローレンス グループは、ケージ PKA 活性化使用される体内形態学的変化とストレスファイバー UV 光分解20に服従させたときの崩壊につながるを示した。以前のいくつかの UCNP シスト、ケージ、小さ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
資金調達 (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2) ありがとうナノ科学と技術学院プログラムと科学省台湾の技術。
Materials
| Reagent | |||
| Tris(hydorxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Amomonium hydroxide (28%-30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 ml | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Novabiochem | 8.51082.0005 | |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12000-14000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscopy | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
Referências
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