Un sistema integrado para activar remotamente Transduction de la señal intracelular por fotoactivación de la cinasa mediada por nanopartículas de conversión ascendente
Summary
En este protocolo, jaula de la proteína quinasa A (PKA), un bioeffector de transducción de señal celular, fue inmovilizada en una superficie de nanopartículas, microinyectado en el citosol y activado por producir UV luz de radiación de infrarrojo cercano (NIR), induciendo desintegración de la fibra de estrés aguas abajo en el citosol.
Abstract
Upconversion nanopartículas (UCNP)-mediada de la fotoactivación es un nuevo enfoque a distancia control bioeffectors con mucho menos fototoxicidad y con una penetración más profunda del tejido. Sin embargo, la instrumentación existente en el mercado no es fácilmente compatible con la aplicacion de upconversion. Por lo tanto, modificar el instrumento disponible en el mercado es esencial para esta investigación. En este artículo ilustramos primero las modificaciones de un Fluorímetro convencional y microscopio de fluorescencia para hacerlos compatibles para los experimentos de upconversion del fotón. A continuación se describe la síntesis de un infrarrojo cercano (NIR)-desencadenó la jaula de la proteína kinase A subunidad catalítica (PKA) inmovilizada en un complejo UCNP. Parámetros para la microinyección y NIR fotoactivación procedimientos también se divulgan. Después de la PKA-UCNP enjaulado es microinyectado en células de fibroblastos REF52, la irradiación NIR, que es significativamente superior a la irradiación UV convencional, eficientemente activa la vía de transducción de señal PKA en las células vivas. Además, experimentos de control positivos y negativos confirma que la vía inducida por la PKA llevando a la desintegración de las fibras de estrés se activa específicamente por la irradiación NIR. Así, el uso de proteína modificada UCNP proporciona un enfoque innovador para remotamente controlar experimentos celulares luz modulada, en la que debe evitarse la exposición directa a los rayos UV.
Introduction
Proteínas químicamente modificadas que pueden ser fotoactivado (por ejemplo, proteínas PKA enjaulado) se han desarrollado como un campo emergente en Biología química a manipular no invasiva los procesos bioquímicos intercelulares1,2 ,3. Usando la luz como un estímulo ofrece excelente resolución espaciotemporal al activar estos enjaulado proteínas. Sin embargo, la luz UV puede causar no deseados cambios morfológicos, apoptosis y daño en el ADN a las células4,5. Por lo tanto, los acontecimientos recientes en el diseño de grupos de photocaging se centran en que fotorrotura sobre excitación de longitud de onda más largas o dos fotones para reducir fototoxicidad, así como para aumentar la penetración de tejido profundo6,7. Grupos de jaulas que responden a la longitud de onda más largo permitiendo elegir convenientes uncaging las longitudes de onda (es decir, canales) selectivamente activan bioeffectors cuando dos o más grupos de jaulas son presente7. Teniendo en cuenta estas características útiles, desarrollar nuevos grupos de photocaging de la luz roja es muy importante trabajo aguas arriba en fotoquímicas metodologías para estudios biológicos, que van desde los mecanismos de las reacciones para controlar las actividades celulares8de sondeo. Sin embargo, un grupo de jaulas de dos fotones es normalmente demasiado hidrofóbico debido a la estructura de anillo aromático fusionado, y un grupo de jaulas de luz visible es normalmente organometálicos con ligandos aromáticos. Esta propiedad hidrofóbica/aromático no es adecuada cuando la bioeffector es una proteína o enzima, ya que desnaturaliza el sitio de activación de la enzima/proteína y causa pérdida de la función, aunque la conjugación y fotólisis todavía trabajan en el nivel químico2 ,9.
UCNPs son eficaces transductores que convierten la luz de excitación NIR a los rayos UV. Esta propiedad única y fascinante de UCNPs ha ofrecido resoluciones realistas para enfrentar los retos asociados con fotoactivación y desencadena la liberación controlada de moléculas pequeñas, incluyendo ácido fólico10, derivados del cisplatino11 , ADN/siRNA12copolímero vesículas13y partículas huecos14. Sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, la fotoactivación UCNP asistida de enzimas o proteínas no ha sido probado hasta ahora. Porque no hay ningún caso exitoso de usar luz roja o NIR a fotoactivos enzima, nos impulsó a realizar la activación activa NIR de una construcción de la proteína/enzima compuesta por complejos de enzima enjaulado químicamente modificado con una cubierta de sílice, dopados con lantánidos UCNP15. En este estudio, el UCNP fue conjugado con una quinasa de transducción de señal rápidamente reaccionando en forma de PKA enjaulado. PKA controla la síntesis de glicógeno y citoesqueleto Reglamento que responde a los estímulos externos vía regulación del fosfato (campo) de adenosina cíclica en el citosol16. Se estudió la viabilidad de la activación de la enzima de formas temporales y espaciales en un experimento de celular después de la irradiación NIR. Esta plataforma asistida UCNP fotoactivación es una nueva metodología para Fotoactivar enzima usando NIR y evita la respuesta de transducción de señal no deseada de las células causadas por convencionales UV irradiación2,4.
Es muy difícil que translocan grande bioeffectors (p. ej., proteínas) a través de la membrana de la célula para controlar la actividad celular. Aunque la proteína inmovilizada de partícula puede ser más fácil que translocan a través de endocitosis en el citosol, endocitosis pueden dañarse o degradarse vía endosomal atrapamiento y la consiguiente degradación lisosomal2,4. Aunque la proteína enjaulada es todavía funcional después de translocación de membrana, las cantidades translocadas pueden no ser suficiente para desencadenar la respuesta celular2,17. En contraste, microinyección es un acercamiento directo y cuantitativo para ofrecer grandes bioeffectors al citoplasma de la célula. Además, bioeffector inmovilizado UCNP requiere producir luz para activarse. Por lo tanto, la instrumentación óptica adicional requiere modificación para medir, visualizar y utilizar la luz de upconversion. En este trabajo, la entrega de un complejo de PKA UCNP enjaulado en una celda utilizando microinyección y las siguientes modificaciones esenciales, microscopia y espectroscopia de NIR fotoactivación se describen en detalle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Previamente, Hofmann y compañeros de trabajo encontraron que cambios morfológicos dramáticos fueron observados en células REF52 después de la microinyección de la PKA gratis19. En otro estudio, el grupo de Lawrence demostró que PKA enjaulado puede ser activado en vivo, lleva a cambios morfológicos y la desintegración de las fibras de estrés cuando es expuesto a UV fotólisis20de. Anteriores informes sobre explotación de UV de producir luz por fotoactivac…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Nano Ciencia y tecnología programa de Academia Sinica y el Ministerio de ciencia y tecnología de Taiwán por los fondos (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Reagent | |||
| Tris(hydorxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Amomonium hydroxide (28%-30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 ml | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Novabiochem | 8.51082.0005 | |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12000-14000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscopy | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
Referências
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