Ett integrerat System att distans utlösa intracellulära signaltransduktion genom uppkonvertering nanopartikel-medierad Kinase ljusaktivering
Summary
I detta protokoll, Bur proteinkinas A (PKA), en cellulära signaltransduktion bioeffector, var orörlig på en nanopartikel yta, microinjected i cytosolen och aktiveras av matas ut UV-ljus från nära infrarött (NIR) bestrålning, förmå nedströms stress fiber sönderfall i cytosolen.
Abstract
Uppkonvertering nanopartiklar (UCNP)-medierad ljusaktivering är ett nytt förhållningssätt till distans kontroll bioeffectors med mycket mindre fototoxicitet och med djupare vävnad penetration. Befintliga instrument på marknaden är dock inte lätt kompatibel uppkonvertering ansökan. Ändra det kommersiellt tillgängliga instrumentet är därför avgörande för denna forskning. I detta papper illustrera vi först ändringarna av en konventionell fluorimeter och fluorescens Mikroskop för att göra dem kompatibla för photon uppkonvertering experiment. Vi beskriver sedan syntesen av ett infrarött (NIR)-utlöst bur protein kinase A katalytisk subenhet (PKA) orörlig på ett UCNP-komplex. Parametrar för Mikroskop och NIR ljusaktivering förfaranden redovisas också. Efter den bur PKA-UCNP är microinjected i REF52 fibroblast celler, utlöser NIR bestrålning, som är signifikant bättre än konventionella UV-bestrålning, effektivt PKA signaltransduktion vägen i levande celler. Positiv och negativ kontroll experiment bekräftar dessutom att PKA-inducerad vägen leder till upplösningen av stress fibrer specifikt utlöses av NIR bestrålning. Användningen av protein-modifierat UCNP ger således en innovativ metod för att fjärrstyra ljus-modulerat cellulära experiment, där direkt exponering för UV-ljus måste undvikas.
Introduction
Kemiskt modifierade proteiner som kan vara photoactivated (t.ex. PKA bur proteiner) har utvecklats som ett framväxande fält i kemisk biologi att icke-invasivt manipulera intercellulära biokemiska processer1,2 ,3. Med ljus som en stimulans ger utmärkt spatiotemporal upplösning när aktivera dessa bur proteiner. UV-ljus kan dock orsaka oönskad morfologiska förändringar, apoptos och DNA skada celler4,5. Därför fokuserar senaste utvecklingen i utformningen av photocaging grupper på att aktivera photocleavage vid längre våglängd eller två-photon magnetisering att minska fototoxicitet, samt för att öka djup vävnad penetration6,7. Caging grupper som svarar på längre våglängd att låta oss att välja lämplig uncaging våglängder (dvskanaler) selektivt aktivera bioeffectors när två eller fler caging grupper är närvarande7. Med tanke på dessa användbara funktioner, är utveckla nya rött ljus photocaging grupper mycket viktiga uppströms arbete i fotokemiska metoder för biologiska studier alltifrån sondera mekanismerna av reaktioner på kontroll av cellulära aktiviteter8. Ändå, en två-photon caging grupp är normalt alltför hydrofoba på grund av den smält aromatiska Ringstrukturen och en caging grupp för synligt ljus är normalt metallorganiska, med aromatiska ligander. Hydrofoba/aromatiska egenskapen är inte lämplig när bioeffector är en protein eller enzym, denaturerar webbplatsen aktivering av enzym/protein och orsakar förlust av funktion, även om de konjugation och fotolys fortfarande arbetar på kemisk nivå2 ,9.
UCNPs är effektiv givare som konverterar NIR excitation ljuset till UV. Denna unika och fascinerande egenskap hos UCNPs har erbjudit realistiska lösningar på de utmaningar i samband med ljusaktivering och utlöste kontrollerad frisättning av små molekyler, inklusive folsyra10, cisplatin derivat11 , DNA/siRNA12, sampolymer blåsor13och ihåliga partiklar14. Dock till bäst av vår kunskap, har den UCNP-assisted ljusaktivering av enzymer eller proteiner inte testats hittills. Eftersom det inte finns något framgångsrika fall att använda rött ljus eller NIR till fotoaktiva ett enzym, uppmanades vi att utföra NIR-utlöst aktiveringen av en protein/enzym-konstruktion som består av kemiskt modifierad bur enzym komplex med en kvarts-belagd, lanthanide-dopade UCNP15. I denna studie var UCNP konjugerat med ett snabbt reagerande signaltransduktion kreatinkinas i form av bur PKA. PKA styr glykogensyntesen och cytoskeletal förordning som svarar på yttre stimuli via cykliskt adenosin fosfat (cAMP) reglering i cytosolen16. Vi studerade genomförbarheten av enzym aktivering i tidsmässiga och rumsliga seder i en cellulär experiment efter NIR bestrålning. Denna UCNP-assisted ljusaktivering plattform är en ny metod att photoactivate ett enzym som använder NIR och undviker oönskade signaltransduktion svaret från celler som orsakas av konventionella UV bestrålning2,4.
Det är mycket svårt att translocate stora bioeffectors (t.ex. proteiner) över cellmembranet att styra cellulär aktivitet. Även om partikel-orörlig protein kan vara lättare att translocate via endocytos i cytosolen, kan endocytos skadas eller försämras via endosomal brottsprovokation och åtföljande lysosomal nedbrytning2,4. Även om proteinet bur är fortfarande funktionell efter membran translokation, kanske flyttade beloppen inte tillräckligt för att utlösa den cellulära svar2,17. I skarp kontrast är Mikroskop en direkt och kvantitativ strategi att leverera stora bioeffectors till cytoplasman i cellen. Dessutom kräver UCNP-orörlig bioeffector matas ut ljus aktiveras. Optiska instrument kräver därför ytterligare modifiering för att mäta, visualisera och utnyttja uppkonvertering ljuset. I detta arbete, kommer leverans av en bur PKA-UCNP-komplex till en cell som använder Mikroskop och följande väsentliga spektroskopi och mikroskopi ändringar för NIR ljusaktivering att beskrivas i detalj.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidigare, Hofmann och medarbetare fann att dramatiska morfologiska förändringar observerades i REF52 celler efter Mikroskop av gratis PKA19. En annan studie visat gruppen Lawrence att bur PKA kan vara aktiverad i vivo, leder till morfologiska förändringar och upplösningen av stress fibrer när de utsätts för UV fotolys20. Tidigare rapporter om att utnyttja matas ut UV-ljus för ljusaktivering visade aktivering av den flera UCNP-assisted, Bur, små molekylär…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar den Nano Science och Technology Program av Academia Sinica och ministeriet för vetenskap och teknik i Taiwan för finansiering (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Reagent | |||
| Tris(hydorxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Amomonium hydroxide (28%-30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 ml | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Novabiochem | 8.51082.0005 | |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12000-14000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscopy | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
Referências
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of “Caged” and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -. D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells – Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
