Un sistema integrato di attivare remotamente la trasduzione del segnale intracellulare di fotoattivazione Upconversion Nanoparticle-mediata della chinasi
Summary
In questo protocollo, gabbia della proteina chinasi A (PKA), un bioeffector di trasduzione del segnale cellulare, era immobilizzata su una superficie di nanoparticelle, microiniettata nel cytosol e attivata da upconverted UV luce da irradiazione di vicino infrarosso (NIR), che inducono disintegrazione di fibra a valle dello stress nel citosol.
Abstract
Upconversion delle nanoparticelle (UCNP)-mediata fotoattivazione è un nuovo approccio in remoto il controllo bioeffectors con molto meno fototossicità e con più profonda penetrazione del tessuto. Tuttavia, la strumentazione esistente sul mercato non è facilmente compatibile con upconversion applicazione. Pertanto, modificando lo strumento disponibile in commercio è essenziale per questa ricerca. In questa carta, illustriamo prima le modifiche di un fluorimetro convenzionale e microscopio a fluorescenza per renderli compatibili per gli esperimenti di upconversion di fotone. Descriviamo quindi la sintesi di un vicino-infrarosso (NIR)-attivato in gabbia proteina chinasi A sola subunità catalitica (PKA) immobilizzati su un complesso UCNP. Parametri per microiniezione e NIR fotoattivazione procedure inoltre sono segnalati. Dopo il PKA-UCNP in gabbia è microiniettati in cellule del fibroblasto REF52, l’irradiazione di NIR, che è significativamente superiore all’irradiazione UV convenzionale, attiva in modo efficiente la via di trasduzione del segnale PKA in cellule viventi. Inoltre, esperimenti di controllo positivi e negativi confermano che la via di PKA-indotta che conduce alla disintegrazione delle fibre di stress specificamente è innescata da irradiazione di NIR. Così, l’uso di UCNP proteina-modificato fornisce un approccio innovativo per il controllo remoto esperimenti cellulari luce modulata, in cui l’esposizione diretta ai raggi UV deve essere evitato.
Introduction
Proteine chimicamente modificati che possono essere fotoattivazione (ad es., proteine PKA in gabbia) sono state sviluppate come campo emergente in biologia chimica non invadente manipolare i processi biochimici intercellulari1,2 ,3. Utilizzando la luce come uno stimolo fornisce un’eccellente risoluzione spazio-temporale durante l’attivazione di questi ingabbiati proteine. Tuttavia, la luce UV può causare indesiderati cambiamenti morfologici, apoptosi e danno del DNA in cellule4,5. Quindi, recenti sviluppi nella progettazione dei gruppi di photocaging di concentrano sull’attivazione photocleavage lunghezza d’onda o due-fotone eccitazione per ridurre fototossicità, nonché per aumentare la penetrazione dei tessuti profondi6,7. Attivare gruppi di ingabbiamento che rispondono alla lunghezza d’onda maggiore, permettendoci di scegliere adatto uncaging lunghezze d’onda (cioè, canali) a selettivamente bioeffectors quando due o più gruppi di ingabbiamento sono presenti7. Date queste caratteristiche utili, lo sviluppo di nuovi gruppi di luci rosse photocaging è un lavoro molto importante a Monte in fotochimiche metodologie per gli studi biologici che vanno da sondare i meccanismi delle reazioni al controllo di attività cellulari8. Tuttavia, un gruppo di ingabbiamento del due-fotone è normalmente troppo idrofobico a causa della struttura fusa anello aromatico, e un gruppo di ingabbiamento di luce visibile è normalmente organometallico, con ligandi aromatici. Questa proprietà idrofobe/aromatico non è adatta quando la bioeffector è una proteina o un enzima, che denatura il sito di attivazione della proteina/enzima e causa la perdita di funzione, anche se la coniugazione e la fotolisi continuano a funzionare a livello chimico2 ,9.
UCNPs sono efficaci trasduttori che convertono la luce di eccitazione di NIR a UV. Questa proprietà unica e affascinante di UCNPs ha offerto risoluzioni realistici per affrontare le sfide associate fotoattivazione e attivato il rilascio controllato di piccole molecole, tra cui l’acido folico10, cisplatino derivati11 , DNA/siRNA12, copolimero vescicole13e particelle cava14. Tuttavia, al meglio della nostra conoscenza, il UCNP-assistita fotoattivazione di enzimi o proteine è non stato testato finora. Perché non esiste nessun caso di successo dell’utilizzo di luce rossa o NIR per fotoattivi un enzima, ci hanno richiesto di eseguire l’attivazione di un costrutto di proteine/enzimi composto da complessi di chimicamente modificati degli enzimi in gabbia con un silice rivestite, NIR-innescato drogato con lantanidi UCNP15. In questo studio, il UCNP è stato coniugato con una reazione rapida chinasi di trasduzione di segnale sotto forma di PKA in gabbia. PKA controlla la sintesi del glicogeno e regolazione del citoscheletro che risponde agli stimoli esterni tramite regolamento di fosfato (accampamento) adenosina ciclica nel cytosol16. Abbiamo studiato la fattibilità di attivazione enzimatica in maniere temporale e spaziale in un esperimento cellulare dopo irradiazione di NIR. Questa piattaforma di fotoattivazione assistita da UCNP è una nuova metodologia per photoactivate un enzima utilizzando NIR ed evita la risposta di trasduzione del segnale indesiderato dalle cellule causata da convenzionale UV irradiazione2,4.
È molto difficile traslocano nel grande bioeffectors (ad es., proteine) attraverso la membrana cellulare per controllare l’attività cellulare. Sebbene immobilizzata particella proteina potrebbe essere più semplice traslocano tramite endocitosi nel cytosol, endocitosi possono essere danneggiati o deteriorati via endosomal allettamento e il conseguente degradazione lisosomiale2,4. Anche se la proteina in gabbia è ancora funzionante dopo traslocazione di membrana, gli importi spostati potrebbero non essere sufficiente a innescare la risposta cellulare2,17. In netto contrasto, microiniezione è un approccio diretto e quantitativo per offrire grande bioeffectors nel citoplasma della cellula. Inoltre, bioeffector UCNP-immobilizzata richiede luce upconverted da attivare. Pertanto, la strumentazione ottica richiede ulteriori modifiche per misurare, visualizzare e utilizzare la luce upconversion. In questo lavoro, la consegna di un complesso di PKA-UCNP in gabbia per una cella mediante microiniezione e le seguenti modifiche essenziali di spettroscopia e microscopia per NIR fotoattivazione descriveremo in dettaglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
In precedenza, Hofmann e colleghe trovano che drammatici cambiamenti morfologici sono stati osservati in cellule REF52 dopo la microiniezione del libero PKA19. In un altro studio, il gruppo di Lawrence ha dimostrato che la PKA in gabbia può essere attivata in vivo, portando a cambiamenti morfologici e la disintegrazione delle fibre di stress quando sottoposti a fotolisi UV20. Precedenti rapporti sullo sfruttamento upconverted UV luce per fotoattivazione ha mostrat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Nano scienze e tecnologia programma di Academia Sinica e il Ministero della scienza e tecnologia di Taiwan per il finanziamento (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Reagent | |||
| Tris(hydorxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Amomonium hydroxide (28%-30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 ml | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Novabiochem | 8.51082.0005 | |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12000-14000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscopy | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
Referências
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