الزخرفة البروتينات النشطة بيولوجيا أو الببتيدات على استخدام الكيمياء الضوئية للتطبيقات البيولوجية المائية
Summary
في هذا الأسلوب، ونحن نستخدم فوتوبوليميريزيشن وتقنيات الكيمياء انقر لإنشاء أنماط البروتين أو الببتيد على السطح من البولي إيثيلين غليكول (شماعة) الهلاميات المائية، توفير معطلة إشارات النشطة بيولوجيا لدراسة الاستجابات الخلوية في المختبر .
Abstract
وهناك العديد من المحفزات البيولوجية التي يمكن أن تؤثر على التمييز بين السلوك والخلايا الجذعية خلية. خلية عامة الثقافة نهج الاعتماد على العوامل القابلة للذوبان داخل وسيلة للتحكم في سلوك الخلية. ومع ذلك، لا يمكن تقليد الإضافات القابلة للذوبان بعض إشارات زخارف، مثل ربط مصفوفة عوامل النمو، مما يشير إلى خلية خلية، والرموز البيوكيميائية المكانية، التي تعد شائعة التأثيرات على الخلايا. وعلاوة على ذلك، الخصائص الفيزيائية للمصفوفة، مثل صلابة الركازة، دوراً هاما في مصير الخلية، الذي هو عدم التلاعب بسهولة باستخدام الخلية التقليدية استزراع الممارسات. في هذا الأسلوب، يصف لنا بروتوكولا مباشرة لتوفير البروتينات النشطة بيولوجيا منقوشة في الهلاميات المائية الاصطناعية البولي إثيلين غليكول (الربط) باستخدام الكيمياء الضوئية. يسمح هذا البرنامج لمراقبة مستقلة الركازة صلابة والإشارات البيوكيميائية المكانية. يمكن تحقيق هذه الهلاميات المائية طائفة كبيرة من قيم صلابة فسيولوجيا ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك، أسطح هذه الهلاميات المائية يمكن أن تكون فوتوباتيرنيد مع الببتيدات النشطة بيولوجيا أو البروتينات عبر شرق ثيول انقر الكيمياء ردود الفعل. لقد تم تحسين هذه الأساليب الاحتفاظ بوظيفة البروتين بعد التثبيت السطحي. هذا هو بروتوكول تنوعاً التي يمكن تطبيقها على أي بروتين أو ببتيد من اهتمام لإنشاء مجموعة متنوعة من أنماط. وأخيراً، يمكن رصد خلايا المصنف على أسطح هذه الهلاميات المائية النشطة بيولوجيا مع مرور الوقت كما أنها تستجيب لإشارات محددة مكانياً.
Introduction
وهناك العديد من المنبهات التي تؤثر على سلوك الخلية. وبصفة عامة، تقنيات تثقيف الخلية النموذجية تعتمد على العوامل القابلة للذوبان الحصول على ردود الخلوية؛ ومع ذلك، هناك قيود على هذا النهج. هذه الأساليب غير قادر على دقة عرض جميع زخارف الإشارات شيوعاً وجدت المجراة في. وتشمل هذه الآليات مما يشير إلى المنحاة عوامل النمو، مما يشير إلى خلية خلية، والإشارات البيوكيميائية محددة مكانياً. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تلعب دوراً مهما في التمييز بين السلوك والخلايا الجذعية خلية صلابة الركيزة وهو عدم التلاعب بسهولة باستخدام المشتركة خلية تثقيف الممارسات1،2. النهج مادة بيولوجية توفر منصة جديدة البدء في استكشاف آليات هذه الإشارات. على وجه الخصوص، هي الهلاميات المائية المرشحين ممتازة لضبط الركازة صلابة3،4، شل البروتينات والببتيدات5،6، وخلق أنماط محددة مكانياً7، 8.
الهلاميات المائية تستخدم عادة السقالات في هندسة الأنسجة بسبب تلك القواسم المشتركة الفيزيائية والكيميائية الحيوية مع9،المصفوفة خارج الخلية (ECM)10. البوليميرات الطبيعية هي الخيارات الشائعة للسقالات، كما أنها متوافق حيويا وتوجد في العديد من أنسجة الجسم. الحد من استخدام البوليميرات الطبيعية كركائز أنها تفتقر إلى مويتيس الكيميائية بسهولة التلاعب بها بيوكونجوجيشن. من ناحية أخرى، الهلاميات المائية الاصطناعية، على هذا النحو، ربط، منصات ممتازة لكيمياء المستهدفة11،12. بالإضافة إلى ذلك، عدم الحصول على رد خلوية شماعة الهلاميات المائية ولذلك تستخدم كالعمود الفقري خاملة لإنشاء السقالات النشطة بيولوجيا.
لإنشاء الهلاميات المائية النشطة بيولوجيا، انقر فوتوبوليميريزيشن وشرق ثيول الكيمياء يعملون من ردود الفعل. وتتطلب هذه فوتوريكشنز فوتوينيتياتور ومصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. عندما يتم عرض فوتوينيتياتورس للأشعة فوق البنفسجية، كسر السندات بشكل الجذور. الجذور أطروحات اللازمة للشروع في رد فعل ولكن يمكن أن يؤثر سلبا على بروتين بيواكتيفيتي12،13. ولذلك، من الأهمية بمكان لتحسين فوتوينيتياتور ومرات التعرض للأشعة فوق البنفسجية للحفاظ على بيواكتيفيتي البروتين.
في هذا الأسلوب، يتم توليفها الهلاميات المائية عن طريق أكريلاتي-أكريلاتي سلسلة فوتوبوليميريزيشن النمو. مونومرات شماعة-دياكريلاتي (بيجدا) تتفاعل مع بعضها البعض لتشكيل البوليمر تشعبت الشبكات المسؤولة عن هيكل المائية. سوف تحكم تركيز بيجدا مونومرات داخل الحل السلائف جل صلابة الركازة. سبب الصغيرة المساحة المائية المسام، وبروتينات ECM مثل فيبرونيكتين يمكن إدراجها بسهولة داخل المائية غرض مرفق خلية. أخيرا، يمكن أن تكون هذه الهلاميات المائية السطحية منقوشة مع الببتيدات النشطة بيولوجيا أو البروتينات عن طريق ثيول-شرق انقر فوق الكيمياء ردود الفعل. هنا، سترد الممتص ثيوريا مجاناً داخل المنظومة المائية مع ثيولس الحرة الموجودة على بروتين أو ببتيد عند تعريضه للأشعة فوق البنفسجية. بعد هي معطلة بالبروتينات أو الببتيدات على سطح المائية، يمكن تخزين المائية عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع دون أن تفقد بيواكتيفيتي. وهذا يوفر راحة ومرونة التخطيط التجريبية، وإمكانية التعاون بين مختبرات. عموما، هذا النظام الأساسي يسمح للنشاط الحيوي والمكانية البيوكيميائية السيطرة، مستقلة عن بعضها البعض، لإتاحة الفرصة للتأثير على سلوك الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يوفر طريقة لإنشاء أنماط البروتينات النشطة بيولوجيا للتطبيقات البيولوجية. وهناك عدة التعديلات التي يمكن إجراؤها على التكيف مع هذا البروتوكول لتجارب مختلفة. أولاً، سوف تختلف متطلبات مرفق الخليوي لأنواع مختلفة من الخلايا. إذا كان من الملاحظ في البداية مرفق خلية الفقيرة إلى ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كانت هذه الدراسة أساسا بدعم من المنح المقدمة من “جمعية القلب الأمريكية عالم التنمية المنحة” (12SDG12050083 إلى G.D.)، المعاهد الوطنية للصحة (R21HL102773، R01HL118245 إلى G.D.) والمؤسسة الوطنية للعلوم (كبة-1263455 و CBET-1350240 إلى G.D.).
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
Referências
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
- Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
- Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
- Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
- Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
- Truat’s Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/…/MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017)
- Ellman’s Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017)
- Desalting Columns. GE Life Sciences Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017)
