Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos
Summary
En este método, utilizamos fotopolimerización e inmovilización de técnicas de química haga clic en crear patrones de proteína o péptido en la superficie del hidrogel de polietilenglicol (PEG), proporcionando señales bioactivas para el estudio de las respuestas celulares en vitro .
Abstract
Hay muchos estímulos biológicos que pueden influir en la diferenciación celular de comportamiento y la célula de vástago. General de la célula cultura enfoques dependen de factores solubles en el medio al control celular comportamiento. Sin embargo, adiciones solubles no pueden imitar ciertos motivos, como factores de crecimiento de la matriz-limite de señalización, célula señalización y espaciales señales bioquímicas, que son influencias comunes en las células. Además, propiedades biofísicas de la matriz, como rigidez de sustrato, desempeñan papeles importantes en el destino de la célula, que no es manipulada fácilmente usando celular convencional, prácticas de cultivo. En este método, se describe un protocolo sencillo para proporcionar proteínas bioactivas modeladas en hidrogel sintético polietileno glicol (PEG) con fotoquímica. Esta plataforma permite el control independiente de la rigidez de sustrato y las señales bioquímicas espaciales. Estos hidrogeles pueden lograr una amplia gama de valores de rigidez fisiológicamente relevantes. Además, las superficies de estos hidrogeles pueden ser photopatterned con péptidos bioactivos o proteínas vía tiol-ene en las reacciones química. Estos métodos han sido optimizados para retener la función de la proteína después de la inmovilización de superficie. Se trata de un protocolo versátil que se puede aplicar a cualquier proteína o péptido de interés para crear una variedad de patrones. Finalmente, las células sembradas en las superficies de estos hidrogeles bioactivos pueden controlarse con el tiempo, como responden a señales específicas espacial.
Introduction
Hay muchos estímulos que influyen en comportamiento celular. En general, técnicas de cultivo de célula típica dependen de factores solubles que provocan respuestas celulares; sin embargo, existen limitaciones a este enfoque. Estos métodos no son capaces de mostrar con precisión todos motivos señalización comúnmente en vivo. Tales mecanismos de señalización incluyen factores de crecimiento secuestradas, célula de señalización y señales bioquímicas espacial específica. Además, rigidez de sustrato puede jugar un papel importante en la diferenciación de comportamiento y célula de vástago de la célula y no se manipula fácilmente usando el cultivo común de la célula1,de prácticas2. Biomaterial enfoques ofrecen una nueva plataforma para comenzar a explorar estos mecanismos de señalización. En particular, los hidrogeles son excelentes candidatos para tuning sustrato rigidez3,4, inmovilización de proteínas y péptidos5,6y la creación de patrones espacialmente específica7, 8.
Los hidrogeles se usan como andamios en la ingeniería del tejido fino debido a sus características biofísicas y bioquímicas comunes con la matriz extracelular (MEC)9,10. Polímeros naturales son opciones comunes para andamios, ya que son biocompatibles y se encuentran en muchos tejidos del cuerpo. La limitación del uso de polímeros naturales como sustratos es que carecen de grupos químicos fácilmente manipulables para bioconjugation. Por otro lado, hidrogel sintético, así como PEG, es excelentes plataformas para químicos específicos11,12. Además, hidrogeles de PEG no provocan una respuesta celular y por lo tanto se utilizan como columna vertebral inerte para crear andamios bioactivos.
Para crear hidrogeles bioactivos, fotopolimerización y tiol-ene química se emplean reacciones click. Estos photoreactions requieren un fotoiniciador y una fuente de luz UV. Cuando fotoiniciadores se introducen a la luz UV, bonos rompen para formar radicales. Los radicales de la tesis son necesarios para iniciar la reacción pero pueden afectar negativamente la proteína bioactividad12,13. Por lo tanto, es crucial optimizar el fotoiniciador y tiempos de exposición de rayos UV para mantener la bioactividad de la proteína.
En este método, los hidrogeles se sintetizan mediante fotopolimerización de crecimiento de cadena acrylate-acrilato. PEG-diacrylate (PEGDA) monómeros reaccionan entre sí para formar redes de polímeros ramificados responsables de la estructura del hidrogel. La concentración de monómeros PEGDA dentro de la solución precursora de gel de control de la rigidez del sustrato. Debido al pequeño tamaño del hidrogel de poro, proteínas ECM como la fibronectina pueden ser fácilmente incorporadas en el hidrogel con el fin de archivo adjunto de la celular. Finalmente, estos hidrogeles pueden ser superficie modelada con péptidos bioactivos o proteínas vía tiol-ene en reacciones de química. Aquí, acrilatos libre sin reaccionar dentro del sistema de hidrogel reaccionará con tioles libres en la proteína o péptido cuando se expone a la luz UV. Después de que las proteínas o péptidos son inmovilizados en la superficie del hidrogel, el hidrogel puede almacenarse a 4 ° C durante varias semanas sin perder la bioactividad. Esto ofrece conveniencia, planificación experimental flexible y la posibilidad de colaboración entre laboratorios. En general, esta plataforma permite controlar bioquímica biomecánica y espacial, independiente unos de otros, por la oportunidad de influir en el comportamiento celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo proporciona un método para la creación de patrones de proteínas bioactivas para aplicaciones biológicas. Hay varias modificaciones que pueden realizarse para adaptarse a este protocolo para diversos experimentos. En primer lugar, requisitos de accesorio celular variará para diferentes tipos de células. Si inicialmente se observa un apego pobre celular a los geles, aumentando la concentración de la proteína de la ECM en la solución precursora se recomienda. Otras proteínas de la ECM se pueden util…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado principalmente por donaciones de subvención de desarrollo científico de corazón Asociación Americana (12SDG12050083 a G.D.), los institutos nacionales de salud (R21HL102773, R01HL118245 a G.D.) y la National Science Foundation (CBET-1263455 y CBET-1350240 a G.D.).
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
Referências
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