생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화
Summary
이 방법에서는, 우리 photopolymerization를 사용 하 고 제공 하는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels의 표면에 단백질 또는 펩 티 드 패턴을 만들 수 클릭 화학 기법 움직일 생리 신호 vitro에 세포질 응답의 연구에 대 한 .
Abstract
많은 생물학 자극 셀 동작 및 줄기 세포 분화에 영향을 미칠 수 있다. 일반 셀 문화 접근 제어 셀 동작에 매체 내의 수용 성 요소에 의존합니다. 그러나, 녹는 추가 특정 매트릭스 바인딩된 성장 인자와 같은 모티프, 신호, 셀 셀 신호, 및 일반적인 영향 세포에는 공간 생 화 확 적인 신호를 모방 수 없습니다. 또한, 기판 강성 같은 매트릭스의 생물 속성 하지 쉽게 조작 되 기존의 셀 경작 관행을 사용 하 여 셀 운명에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이 방법에서는, 우리는 합성 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels 광화학을 사용 하 여에 꽃무늬 생리 활성 단백질을 제공 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 플랫폼 기판 강성 및 공간 생 화 확 적인 신호는 독립적으로 제어할 수 있습니다. 이러한 hydrogels 순수 관련 강성 값의 큰 범위를 얻을 수 있습니다. 또한, 이러한 hydrogels 표면 생리 활성 펩 티 드와 photopatterned 또는 단백질 thiol ene 통해 클릭 화학 반응. 이러한 메서드는 표면 동원 정지 후 단백질 기능을 유지 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 어떤 단백질 또는 펩 티 드의 다양 한 패턴을 만들에 적용할 수 있는 다양 한 프로토콜입니다. 마지막으로, 이러한 생리 hydrogels의 표면에 시드 셀 그들은 공간 특정 신호에 응답 시간이 지남에 모니터링할 수 있습니다.
Introduction
셀 동작에 영향을 주는 많은 자극을 확인 하 고 있습니다. 일반적으로, 일반적인 셀 자란 기법; 세포질 응답 유도 용 해 요소에 의존 그러나,이 접근 방식에는 한계가 있다. 이러한 메서드는 일반적으로 모든 신호 모티브를 정확 하 게 표시 수 없습니다 vivo에서. 이러한 신호 메커니즘 등 분리 된 성장 인자, 세포-세포 신호, 공간 특정 생 화 확 적인 신호입니다. 또한, 기판 강성 셀 동작 및 줄기 세포 분화에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 하 고 일반적인 셀 자란 사례1,2를 사용 하 여 쉽게 조작 하지는. 소재 접근 이러한 신호 메커니즘을 탐험을 시작 하는 새로운 플랫폼을 제공 합니다. 특히, hydrogels 기판 강성3,4, immobilizing 단백질 및 펩 티 드5,6, 튜닝 하 고 공간적으로 특정 패턴7, 을 만들기 위한 우수한 후보자는 8.
Hydrogels 건설 기계 조직 공학 세포 외 기질 (ECM)9,10그들의 생물 및 생 화 확 적인 공통점 때문에 일반적으로 사용 됩니다. 천연 고분자 생체 고 신체의 많은 조직에서 발견 되는 건설 기계에 대 한 일반적인 선택입니다. 천연 고분자를 사용 하 여 기판으로의 한계는 그들은 bioconjugation에 대 한 쉽게 조작된 화학 moieties 부족 이다. 다른 한편으로, 합성 hydrogels 같은 말뚝,으로 우수한 플랫폼 대상된 화학11,12. 또한, 말뚝 hydrogels 세포질 응답을 유도 하지 않습니다 하 고 따라서 생리 건설 기계를 만들기 위한 불활성 등뼈로 사용 됩니다.
만들려면 생리 hydrogels, photopolymerization 그리고 thiol ene 클릭 화학 반응 고용 됩니다. 이 photoreactions는 photoinitiator와 UV 광원을 필요로합니다. Photoinitiators는 UV 빛을 소개 하 고, 채권 양식 기를 휴식. 논문 래 디 칼 개시 반응에 필요 하지만 단백질 bioactivity12,13에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, photoinitiator 및 단백질 bioactivity를 유지 하기 위해 자외선 노출 시간을 최적화 하기 위해 결정적 이다.
이 방법에서는, hydrogels 아크릴-아크릴 체인 성장 photopolymerization 통해 합성 됩니다. 못-빛 (PEGDA) 단위체 분기 폴리머 네트워크는 하이드로 겔의 구조에 대 한 책임을 형성 하기 위하여 서로 함께 반응. 솔루션 내에 젤 선구자 PEGDA 단위체의 농도 기판 강성을 제어 합니다. 때문에 작은 크기는 하이드로 겔의 기 공, fibronectin 같은 ECM 단백질 셀 첨부 파일을 위해 하이드로 겔 내에서 쉽게 통합 될 수 있다. 마지막으로, 이러한 hydrogels 생리 활성 펩 티 드 표면 패턴 또는 단백질 thiol ene 통해 클릭 화학 반응. 여기, 하이드로 겔 시스템 내에서 unreacted 무료 아크릴레이트 단백질 또는 펩 티 드 UV 빛에 노출 되 면에 있는 무료 thiols와 반응 합니다. 단백질 또는 펩 티 드 히드로 표면에 움직일 수 있다, 후는 히드로 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 동안 bioactivity의 손실 없이. 이 편의성, 유연한 실험 계획 및 연구소 간의 협력에 대 한 가능성을 제공 합니다. 전반적으로,이 플랫폼 biomechanical 및 공간 생 화 확 적인 제어, 서로 독립적으로, 세포질 행동에 영향을 기회에 대 한 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에는 생물 학적 응용에 대 한 생리 활성 단백질 패턴을 만들기 위한 방법을 제공 한다. 다른 실험을 위해이 프로토콜에 맞게 만들 수 있는 몇 가지 수정이 있다. 첫째, 셀 첨부 파일 요구 사항을 다른 세포 유형에 대 한 달라질 수 있습니다. 가난한 셀 첨부 파일은 젤을 처음 관찰 된 경우 솔루션 내에 전조 ECM 단백질의 농도 증가 시키는 것이 좋습니다. 다른 ECM 단백질 fibronectin, 콜라겐, l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 심장 협회 과학자 개발 보조금에서 교부 금에 의해 주로 지원 되었다 (G.D. 하 12SDG12050083)는 건강의 국가 학회 (R21HL102773, G.D.에 R01HL118245)와 국립 과학 재단 (CBET 1263455 및 G.D. CBET-1350240).
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
Referências
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